广西部分地区警犬狂犬病血清中和抗体调查

徐 陶 杜晓鹏 毛爱国 万九生

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）感染引起的一种致死性人兽共患病，病死率几乎达到100%。目前，对狂犬病尚无有效的治疗方法，而对犬接种狂犬病疫苗是预防狂犬病的最有效措施之一。犬的狂犬病免疫覆盖率低于70%，是诱发人类狂犬病发生的主要原因。2017年全国共报告502例人类狂犬病死亡病例，西南及东南地区是我国人和动物狂犬病高发区域，其中广西发生41例狂犬病死亡病例，位居全国第四。

为了解广西区警犬狂犬病疫苗免疫效果，分析影响警犬免疫合格率的因素，制定适合的警犬免疫程序，提高免疫合格率，本研究对广西区南宁市、桂林市、梧州市、玉林市等4个地区警犬狂犬病疫苗免疫覆盖率及血清中和抗体进行调查。通过随机抽样获得有效样本93份，采用荧光抗体病毒中和试验（FAVN）检测了警犬血清中RABV中和抗体效价。

一、调查对象

根据广西区警犬工作布局情况，选取毗邻湖南的桂林，与广东接壤的梧州、玉林，以及省会城市南宁4个地区进行采样。按照7月龄以上训练犬与工作犬总数量的10%进行抽样：每个性别组按照10%的比例进行间隔抽样；当超过20头时，可按照隔2抽1、隔3抽1的原则抽样，以此类推。共选取了以上4个地区的93头身体健康的警犬作为调查对象。

（一）检测单位分布与警犬数量分布

南宁选取2个训练单位31头警犬，桂林选取5个训练单位26头警犬，梧州选取8个训练单位17头警犬，玉林选取5个训练单位19头警犬。

（二）警犬免疫程序与免疫覆盖率

1.警犬免疫程序

所有警犬均使用统一的狂犬病免疫程序。即在犬出生3月龄时，接种狂犬病灭活疫苗一剂；此后每年加强免疫一次，接种狂犬病灭活疫苗一剂。

2.免疫覆盖率

经查阅档案调查，检测单位警犬狂犬病疫苗免疫覆盖率为100%。

（三）疫苗种类

南宁、桂林、玉林3个地区，以及梧州部分单位选用疫苗为A品牌，犬、猫狂犬病灭活疫苗（Pasteur RIV株，至少2IU）；梧州另有3个单位分别选用B品牌狂犬病灭活疫苗（HCP-SAD株，灭活前不少于106.3FAID50/mL）、C品牌狂犬病弱毒疫苗（Rb/E3株≥105.0LD50/0.03ml）、D品牌狂犬病灭活疫苗（G52株，每头份至少为1IU）。

（四）犬种体型

检测的犬种包括德国牧羊犬、马里努阿犬、昆明犬、罗威纳犬、拉布拉多犬、史宾格犬、寻血猎犬、维兹拉犬与昆马杂交犬，按照中国工作犬管理协会（CWDMA）的犬种分组表，将检测犬分为大型犬（55cm以上）、中型犬（35.1～54.9cm）与小型犬（35cm以下）。本研究涉及的犬种均为中型犬种或大型犬种。

二、材料与方法

（一）待检血清

在警犬狂犬病灭活疫苗免疫后28天，从待检犬前肢头静脉采血至少3mL，静置2h，1500rmp/min离心30min，分离血清，冷冻保存或冷链运输至实验室，备用。出现溶血需重新采取血样并分离血清。

（二）检测试剂

1.标准血清

购自法国欧盟狂犬病血清学参考实验室，效价为5.92IU/mL。

2. 阴性血清

采集自未免疫健康犬，由军事兽医研究所世界动物卫生组织（OIE）狂犬病参考实验制备。

3. 荧光抗体

FITC荧光素标记的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体购自Fujiribio公司。

4. 狂犬病病毒CVS-11细胞毒

军事兽医研究所保存，滴度为106.67TCID50/mL。

（三）检测方法

1. 样本处理

待检血清分别在56℃灭活30min。

2. 检测

采用OIE《陆生动物诊断测试和免疫手册》2013版直接免疫荧光病毒中和试验（FAVN）对待检血清中狂犬病病毒中和抗体效价进行检测。首先对标准血清和待检血清进行3倍梯度稀释，稀释区域第一列各孔内预先加入100µL培养液，每孔加入血清50µL，混匀后吸取50µL加入第二列，依此稀释。取预先确定滴度的狂犬病病毒CVS-11，以MEM培养液稀释至30-300TCID50/50µL，除细胞及培养液对照孔外每孔加入50µL，置37℃中和60min。BHK-21细胞经胰酶消化、分散、计数，稀释至4×105/mL，除培养液对照孔外每孔加入50µL细胞悬液，于37℃ 5%CO2培养箱培养48h。弃细胞培养上清，加入50µL冷丙酮-20℃固定细胞1h，PBST洗涤后，将狂犬病病毒核蛋白荧光抗体稀释至工作浓度，每孔加入50µL工作液，37℃孵育1h。PBST洗涤，荧光显微镜下观察每个孔，孔内有荧光细胞即记为感染，为阳性；无荧光细胞为完全中和，为阴性。基于Spearman-Karber公式的推导公式计算待检血清狂犬病病毒中和效价。

以犬免疫后血清狂犬病病毒中和抗体效价≥0.50IU/mL为阳性标准，达到或超过0.50IU/mL即具有效保护水平。

（四）统计学分析

检测数据，采用SPSS18.0及Excel2007进行分析处理。

三、结果与分析

（一） 93头警犬RABV中和抗体效价检测结果（见表1）。

93头警犬中和抗体阳性57头，整体免疫合格率为61.29%。其中，南宁地区免疫合格率最高，为67.74%；梧州地区最低，为52.94%。两者之间差异显著（P<0.05）。

表1 93头警犬RABV中和抗体检效价检测结果

（二） 不同年龄的警犬RABV中和抗体效价检测结果（见表2）。

本次检测将93头警犬分成7～12月龄、1～2岁、3～6岁、6岁以上4个年龄组，其免疫合格率分别为75.00%、42.86%、64.91%、61.11%；分析表明：1～2岁的免疫合格率最低，仅为42.86%，明显低于7～12月龄、3岁以上犬的免疫合格率，它们之间差异极显著（P<0.01）。

表2 不同年龄的警犬RABV中和抗体效价检测结果

（三） 不同免疫次数的警犬RABV中和抗体效价检测结果（见表3）。

对93头警犬，按照免疫次数分为免疫1次、免疫2～3次、免疫4次及以上3个组，其免疫合格率分别为46.67%、68.00%、62.26%。分析显示，免疫1次的合格率与免疫2～3次、免疫4次及以上之间差异极显著（P<0.01）。

（四） 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗体效价检测结果（见表4）。

使用A疫苗免疫的86头警犬，阳性54份，免疫合格率为62.79%。使用B疫苗免疫的警犬，合格率为75.00%；选用C疫苗、D疫苗的免疫合格率为0%。由于使用B、C、D疫苗的警犬数量分别为4头、2头、1头，不具有统计学意义，对于不同疫苗之间的免疫效果不做统计分析。

（五） 不同体型犬种的警犬RABV中和抗体效价检测结果（见表5）。

本次检测分析的警犬为中型犬种和大型犬种，结果显示：中型犬的免疫合格率为53.33%，大型犬的免疫合格率为65.08%，两者之间差异显著（P<0.05）。

（六） 不同性别的警犬RABV中和抗体效价检测结果（见表6）。

结果显示：检测的62头公犬，阳性38份，免疫合格率为61.29%；检测的31头母犬，阳性19份，免疫合格率为61.29%，两者之间没有差异。

（七） 不同采样时间的警犬RABV中和抗体效价检测结果（见表7）。

表3 不同免疫次数的警犬RABV中和抗体效价检测结果

表4 不同疫苗免疫的警犬RABV中和抗体效价检测结果 单位：份

表5 不同体型的警犬RABV中和抗体效价检测结果

表6 不同性别的警犬RABV中和效价检测结果

表7 不同采样时间的警犬RABV中和效价检测结果

免疫后90d内采样，其免疫合格率可以达到95.65%（22/23）；而在免疫后100d采样，其免疫合格率将出现下降，免疫后120～300d，免疫合格率为25.00%（5/20），免疫后 300d 以上为 60.00%（30/50）。

四、 讨论

（一） 广西区警犬狂犬病疫苗免疫合格率偏低。检测的93头警犬，其总体免疫合格率为61.29%，梧州的免疫合格率仅为52.94%。这一结果低于贵州（68.35%）、四川（76.06%）、海南（74.19%）的狂犬病疫苗免疫合格率。说明需要加强该地区警犬狂犬病疫苗的免疫接种工作。

（二）无效免疫是导致免疫失败的重要原因。广西区3岁以上的检测警犬共计75头，免疫不合格数量则达到27头，其中有10头不合格警犬为南宁某警犬训练单位的全部被检警犬，占不合格警犬数总数的37.04%，其抗体滴度则分布在0.03～0.10IU/mL之间。研究显示：犬的中和抗体水平与免疫次数成正比，免疫次数越多，抗体水平越高，免疫合格率也就越高。而上述免疫不合格的10头警犬，均按照规定的免疫程序至少有3～7次的狂犬病疫苗接种，检测结果则说明，该单位过去几年的狂犬病免疫是无效免疫，未能达到有效的保护。需要进一步地查找免疫失败的原因，尽快调整免疫程序，以达到切实有效的免疫接种。

（三）采样时间与采样数量对免疫合格率有影响。本次调查结果显示，在最后一次狂犬病疫苗免疫后的34d与60d采样，免疫合格率均达到100.00%，而在免疫后90～360d采样，中和抗体水平则出现不同程度的下降，免疫合格率相应下降。到免疫330天以后抗体合格率以降至60%左右，说明每年进行一次狂犬病疫苗的加强免疫是必要的。

（四） 犬的体型大小对免疫合格率有影响。本实验检测对象包括大型犬种与中型犬种，其免疫合格率分别为65.08%、53.33%，差异显著（P<0.05）。有研究证明：犬的体型大小和抗体反应水平之间存在一种普遍的关系，体型较小的犬比体型较大的犬能产生更高的抗体水平。这可能的原因是相同剂量的疫苗，体型越小，抗体反应就越强。本次试验中大型犬的免疫合格率高于中型犬的免疫合格率，这可能与采样的数量及采样时间距离免疫时间的长短有关。

（五） 犬的性别与免疫合格率没有关系。本次调查中，公犬的免疫合格率为61.29%（38/62），母犬的为61.29%（19/31），两者之间没有差异，这与国外相关的研究结果一致，说明犬的性别与免疫合格率没有关系。

五、结论

本次调查结果显示：应加强广西区警犬狂犬病疫苗接种工作，减少无效免疫；警犬的免疫合格率与采样时间、采样数量、免疫次数和体型大小有关，与性别没有关系。