2016—2018年怀化市猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查与分析

邹秀明，印怀文

（1.长沙牧康生物科技有限公司，湖南 长沙 410128；2.湖南省辰溪县畜牧水产局，湖南 怀化 419500）

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）感染所引起繁殖母猪出现严重的繁殖障碍（表现为后备母猪受胎率低、妊娠母猪流产或产死胎、木乃伊胎）和仔猪呼吸障碍及高热等临床症状的一种高发的传染病，给我国养猪业造成很大的经济损失[1-2]。2006年，我国江西地区暴发高致病性蓝耳病（HP-PRRS），其后在我国各地猪场广泛暴发，与古典型毒株相比，感染高致病性毒株的猪群所表现的临床症状更为严重，发病率和死亡率也更高，我国众多养猪人士谈“蓝耳”色变[3]。其后我国2014年河南等诸多地区又暴发类NADC30蓝耳病毒株，使得在我国流行的PRRSV毒株类型复杂，防控形势更加严峻[4]。

本次研究于2017年6月至2018年9月，采用RT-PCR技术对怀化市部分地区猪场送检的326份病料检测PRRSV病原，以了解PRRSV在该地区的流行情况，为怀化市PRRS的防控提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 病料样品来源

本次研究所收集的326份疑似PRRSV感染的病料均来自于怀化市各地区，在这些病料样品中有161份样品来源猪群临床症状表现为妊娠母猪流产、死胎或仔猪呼吸困难等，剩余样品来源猪群未表现以上临床症状。所有样品包括淋巴结、扁桃体、肺脏、肝脏和肾脏等，由各养殖场（户）通过临床解剖后，低温保存送至病原诊断实验室，分别对送检样品进行编号记录相关信息（采样时间、地点和采样部分等）后，保存于-80℃，待检。

1.2 主要试剂与设备

DNA/RNA extraction kit购自于OMEGA公司，反转录试剂盒为天根生物公司产品；2×Taq PCR mix、DL 2 000 Marker等购自于TaKaRa公司；不同规格移液器购自于大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；不同规格的枪头、离心管等购自于华大生物科技有限公司。PCR仪购自于美国Biorad公司；高速低温离心机购自于长沙麦佳森仪器设备有限公司；电泳仪和相应电泳槽购自于北京市六一仪器厂等。

1.3 引物设计与合成

根据GenBank公布的PRRSV不同基因型分离株的基因组序列，我们分别设计了针对经典PRRSV毒株和高致病性PRRSV毒株的诊断引物，所针对的基因片段分别为N基因和NSP2基因，引物名称和序列分别为PRRSV-N-F：5'-TCATCGCCCAACAAA CCAG-3'，PRRSV-N-R：5'-GCGTCGGCAAACTAAA CTCC-3'，扩增片段大小约为 400 bp；HP-PRRSV-N SP2-F：5'-CCTCCGTGGTGCAACAAATCTTG-3'，HPPRRSV-NSP2-R：5'-CGATGATAGCTTGAGCTCAGT AT-3'，扩增片段大小约为1 100 bp。引物送由长沙擎科生物科技有限公司合成。

1.4 病料基因组提取与cDNA合成

将组织病料匀浆，低温高速离心后，按DNA/RNA提取试剂盒说明书对组织上清液中核酸进行提取，以核酸为模板，将其反转录为cDNA样品，保存于-80℃，待检。

1.5 PRRSV病原检测

以cDNA为模板，采用RT-PCR法检测其中是否存在 PRRSV 核酸，体系（25 μL）：2×PCR easy taq mix：12.5 μL；上游引物：1 μL；下游引物：1 μL；cDNA样品：1 μL；无 RNA 酶水：9.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s；56 ℃退火 30 s；72 ℃延伸45 s；共35个循环，其后72℃延伸7 min，每次PCR反应均设置阳性对照和阴性对照，模板分别为PRRSV基因组和无RNA酶水。PCR反应结束后，取5 μL PCR产物进行凝胶电泳，其中凝胶琼脂的浓度为1%，电泳条件为120 V 25 min，电泳结束后在凝胶系统成像仪下观察结果。

2 调查结果

2.1 怀化市不同地区送检样品PRRSV RT-PCR检测结果

本次研究收集的324份送检样品来自于怀化市不同地区的83个猪场，共6个县市地区，分别为沅陵县（18个）、溆浦县（8个）、会同县（10个）、洪江市（11个）、芷江县（15个）和麻阳县（21个），不同被调查县市送检猪场PRRSV场阳性率存在一定差异，为54.55%～80.00%，其中以芷江县最高（80.00%），而洪江市最低，为54.55%。在对不同地区送检样品调查结果进行统计后，发现不同县市送检样品PRRSV检出率为27.78%～68.75%，平均检出率为42.94%（140/326），其中以麻阳县最高，为68.75%，而洪江市最低（27.78%）。详见表1。

表1 怀化市不同地区送检样品PRRSV RT-PCR检测结果

2.2 不同临床表现猪群PRRSV RT-PCR检测结果

本次收集的326份样品来源病猪的临床症状有所不同，其中主要分为妊娠母猪流产、死胎，保育猪或肥育猪呼吸困难、高热等，样品数量分别为68份和93份，表现其它临床症状样品数量为165份。RT-PCR检测结果如表2所示，PRRSV是导致妊娠母猪流产、死胎和猪群出现高热和呼吸困难等症状的主要病原之一，其检出率分别为54.51%（37/68）和52.69%（49/93），而表现其它临床症状发病猪群的PRRSV检出率为37.72%（54/165）。

表2 不同临床表现猪群PRRSV RT-PCR检测结果

2.3 PRRSV不同毒株感染情况调查结果

应用两种检测不同型的PRRSV毒株引物对样品进行检测，结果发现140份阳性样品中单一感染经典型PRRSV的病料样品为48份，阳性率为14.72%（48/326），阳性样品中所占比例为34.39%（48/140），单一检测为高致病性PRRSV的病料样品有69份，阳性率为21.17%（69/326），阳性样品中所占比例为49.29%（69/140），而其它属于混合感染高致病性PRRSV和经典型PRRSV，共23份，检出率为7.01%（23/326），阳性样品中所占比例为16.43%（23/140）。

3 分析与讨论

自高致病性PRRSV在我国暴发与流行以来，我国政府与相关机构花费大量的精力用于监测国内PRRSV分子流行情况与遗传变异情况，为相应的疫苗开发与疫病防控提供参考。本次研究于2017年6月至2018年9月对怀化市部分地区猪场送检的326份疑似病料样品进行PRRSV病原检测，RTPCR诊断结果表明该地区送检病料中PRRSV检出率为42.94%（140/326），之前怀化市疾控中心曾对屠宰场健康猪群扁桃体样品进行病原检测，其中PRRSV和HP-PRRSV的检出率分别为13.61%和3.89%[5]，说明PRRSV是引起怀化市猪群发病的主要病原之一，且流行情况较为严重。

笔者及团队对此次研究调查的样品进行统计与分类，发现怀化市不同地区送检样品中PRRSV检出率存在差异，为27.78%～68.75%，平均检出率为 42.94%（140/326），其中以麻阳县最高，为68.75%，而洪江市最低（27.78%），且被调查的83个猪场中场阳性率为65.06%（54/83）。诚然，PRRSV广泛流行于怀化市不同地区猪场，对该市生猪养殖业健康发展威胁巨大。通过对样品临床症状表现进行分类和统计，发现繁殖母猪表现为流产、死胎等临床症状的样品中PRRSV检出率为54.51%（37/68），而表现高热、呼吸困难的猪群样品检出率为52.69%（49/93）。PRRSV是导致猪群繁殖与呼吸障碍的主要病原之一，但被调查猪群也存在感染其它病原的可能，如伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型和猪瘟病毒等，对病料的混合感染其它病原的状况还需要进一步调查与统计。此外，140份PRRSV阳性样品中单一感染经典型毒株和高致病性毒株的样品数量分别为48和69份，混合感染两种类型毒株样品数量为23份，在阳性样品中所占比例分别为34.39%（48/140）、49.29%（69/140）和 16.43%（23/140），说明该地区的确存在两种不同类型PRRSV毒株流行的情况，其中部分猪场甚至存在两种类型毒株流行的情况，提示在怀化市地区流行的PRRSV毒株类型较为复杂，应加强分子流行病学监测，为疫病的防控与净化提供数据支持。