糖尿病肾脏病大鼠造模方法的改进及肾组织IL-10表达水平

曹东东 黎妞 曹子彧 侯玉龙 倪文娟 冷小敏 刘云 师晶晶 郭明好 马东红

453100 卫辉，河南省新乡医学院第一附属医院肾脏病医院肾脏免疫研究所(曹东东，黎妞，倪文娟，刘云，马东红，曹子彧，侯玉龙，师晶晶，郭明好)，生命科学研究中心(冷小敏)

糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)主要并发症之一，由其引起的终末期肾病的发病率正逐年上升[1]，但其发病机制至今尚未完全阐明。以往的研究认为，高血糖、游离脂肪酸和胰岛素抵抗诱导了代谢失衡和DKD启动，而近年来炎症被认为在DKD发展中起到重要作用[2-3]。白介素10(interleukin-10，IL-10)作为一种抗炎细胞因子，已被证实可以限制促炎细胞因子的激活[4]。有研究通过IL-10对小鼠系膜增生性肾小球肾炎的抑制实验发现IL-10可减少炎症细胞募集和系膜细胞增殖[5]。当IL-10通过基因治疗的方式被传递给自然发生肾衰竭的小鼠时，可有效减少蛋白尿及预防小鼠肾小球硬化的发生，提示IL-10基因治疗可以用于肾衰竭治疗[6]。因此建立良好的DKD动物模型对研究其发病机制及治疗该疾病具有重要意义。

目前DKD模型建立主要包括：高糖高脂联合链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、单侧肾切联合STZ、转基因动物模型。有研究通过腹腔注射STZ联合单侧切除肾脏的方法加速肾脏损伤，缩短实验周期[7]，但该方法操作复杂、腹腔感染和死亡率高，也不符合正常DKD正常生理发病机制。转基因动物模型通过人为对动物基因进行修饰，但该方法明显加大了遗传因素在DKD发病过程中的主导作用，并且该模型价钱昂贵，这也限制了该模型的应用。同时目前国内外对于DKD成模时间、成模标准均不统一[8-9]，有些研究经常将DM造模成功后默认为DKD模型进行后续研究，这是欠妥的，以上差异往往会影响模型成功率和可重复性。因此本研究在前人基础上对DKD大鼠造模方法进行改进并检测大鼠肾组织IL-10水平变化，为开辟新型IL-10的DKD治疗策略提供理论依据。

材料与方法

一、材料

1.实验动物和喂养 48只清洁级健康雄性SD大鼠[购买于山西医科大学实验动物中心，合格证号：180325，生产许可证号：SCXK(晋)20150001]，体质量160～200 g，月龄5～8周，自由饮水和摄食，室温控制在(24±2)℃，湿度45%～50%，自然光照。

2.主要试剂与仪器 高糖高脂饲料(货号：HD001，博泰宏达生物技术有限公司)；STZ(货号：S0130，Sigma公司)；柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(笃玛生物技术有限公司)；DAB显色试剂盒、HE染色试剂盒(索来宝公司)；IL-10抗体(货号：DF6894，Affinity公司)；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)HRP(货号：AB0101，Abways公司)；贝克曼AU5800全自动生化分析仪(美国贝克曼库尔特公司)；FUS-2000全自动尿液分析仪(上海伊沐医疗器械有限公司)；光学显微镜(赛默飞世尔公司)；BM-IX生物组织包埋机(孝感市宏业医用仪器有限公司)；罗氏血糖仪活力型及配套血糖试纸条(美国罗氏公司)。

二、实验方法

1.动物模型的建立 48只雄性SD大鼠适应性喂养1周，随机分为正常对照组(NC组，n=24)和糖尿病组(DM组，n=24只)，NC组以常规饲料喂养，DM组以高糖高脂饲料喂养。6周后两组禁食不禁水16 h，DM组按40 mg/kg一次性腹腔注射STZ(将STZ溶于0.1 mmol/L pH 4.5的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浓度为1%，避光，现配现用)，NC组给予等剂量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液一次性腹腔注射。STZ注射后分别于72 h、1周后测随机血糖大于16.7 mmol/L、测尿糖2次均为阳性，则为DM造模成功[10]，DM组继续以高糖高脂喂养。

2.标本的收集 造模成功后分别于0、4、8、12周从两组中各处死6只大鼠，处死前用代谢笼收集随机尿液，检测尿微量白蛋白、尿肌酐及尿糖，计算尿微量白蛋白/尿肌酐比(urinary protein creatinine ratio，UACR)；用10%水合氯醛进行腹腔麻醉，然后进行心脏灌注，先以生理盐水灌至澄清，再以4%多聚甲醛固定，取出肾脏并去除肾包膜，冠状面切开肾脏置于多聚甲醛中进行固定，用于后续进行常规HE染色、PAS染色、Masson三色法染色、PASM法染色及免疫组化检测。

3.测量指标及方法 (1)生化指标的检测：尿微量白蛋白、尿肌酐采用全自动生化分析仪，并计算UACR，UACR(mg/g)=尿微量白蛋白(mg/L)/尿肌酐(μmol/L)×8840，尿糖采用全自动尿液分析仪。血糖检测使用罗氏血糖仪及配套试纸。

(2)肾组织病理：取出固定好的肾脏标本石蜡包埋切片，切片厚度约2～3 μm，常规二甲苯脱蜡，100%、95%、80%、65%梯度酒精脱水，进行HE染色、PAS染色、Masson三色法染色、PASM法染色，光镜下观察肾脏病理改变。

(3)免疫组化检测肾组织IL-10表达：4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片厚度约2～3 μm，二甲苯脱蜡、各级酒精脱水，微波抗原修复，3% H2O2去除内源性过氧化物酶，5%BSA封闭，滴加鼠抗兔IL-10一抗(1∶50)37℃ 1h或4℃过夜，滴加羊抗兔IgG辣根过氧化物酶二抗，DAB显色后苏木素染核，封片，阴性对照以PBS取代一抗。应用Image-pro plus 6.0软件对每张切片阳性细胞数测量累计光密度值以及组织的像素面积，得到平均光密度值。

三、统计学处理

结 果

一、DM造模结果

与NC组相比，DM组大鼠在注射STZ 72 h、1周后采尾静脉血测随机血糖大于16.7 mmol/L、尿糖阳性的有18只，成模率为75%，随后对未成模大鼠以1%STZ 30 mg/kg进行补充，再次测血糖均达成模标准，至实验结束共死亡3只大鼠。实验期间观察DM组大鼠多饮、多食、多尿症状明显，毛发发黄、晦暗；NC组大鼠状态良好，体质量逐渐增加。

二、两组大鼠的一般项目和血生化指标比较

同期两组大鼠在0、4、8周时体质量相比较无差异，至第12周时，DM组大鼠平均体质量为(478.0±79.1)g，明显低于NC组(650.0±26.9)g，差异有统计学意义(P<0.05)，且与DM组相比，NC组体质量增长明显；DM组大鼠血糖在造模成功后0周血糖(25.6±5.3)mmol/L，显著高于NC组(5.2±0.2)mmol/L，直至实验结束发现血糖仍维持在(23.0±5.5)mmol/L；DM组大鼠UACR在8周、12周分别为(39.0±18.6)mg/g、(77.0±12.3)mg/g，均显著高于同期对照组(15.1±5.4)mg/g、(15.8±7.0)mg/g，差异有统计学意义(P<0.05)。(图1)

三、肾脏病理结构改变

NC组不同时期光镜下大鼠肾小球、肾小管、肾间质均未见明显异常；DM组各期在光镜下各种染色均可显示肾间质水肿、炎细胞浸润，于第12周肾小球基底膜轻度增厚，肾小管上皮细胞空泡变性(图2)。

四、两组大鼠肾组织IL-10表达比较

采用免疫组化检测两组肾组织IL-10的表达，IL-10阳性表达区域呈棕黄色，且IL-10表达主要集中在肾小管的上皮细胞，可见在两组中均有表达。NC组各期肾组织IL-10表达量较同期DM组较高(P<0.05)，且DM组不同时期相比IL-10表达无统计学差异。(图3、图4)

讨 论

DKD已成为终末期肾病首要病因，但发病机制目前尚未完全阐明，构建理想的DKD动物模型对研究该疾病发病机制及提供相应的干预措施十分重要。本课题组通过查阅大量国内外文献，发现高糖高脂饮食联合小剂量STZ已成为研究DKD模型的常用方法。本研究通过高糖高脂联合小剂量STZ(40 mg/kg)成功建立DM模型，DM组大鼠出现明显多饮、多食、多尿症状，且至12周DM组大鼠体质量为(478.0±79.1)g，明显低于NC组(650.0±26.9)g；DM组大鼠血糖于造模成功后0周即显著高于NC组(25.6±5.3)mmol/L，直至实验结束发现血糖仍维持在(23.0±5.5)mmol/L；与NC组相比，DM组在0周时UACR水平较高，而在4周再次测量显示UACR趋于下降，分析其原因为0周时DM组大鼠由于高血糖引起高渗透压，使肾脏处于高滤过状态导致大鼠尿微量白蛋白排泄增多[11]，至8周后UACR与同期对照组相比均较高，提示肾脏损伤不断加重；此外，与NC组相比，DM组肾脏病理光镜下各种染色均可显示肾间质水肿、炎细胞浸润，于第12周出现肾小球基底膜轻度增厚，肾小管上皮细胞空泡变性，相比一些文献报道8周即伴有肾小球基底膜增厚、系膜细胞基质增多有所差异[10]。另外本研究还对大鼠肾组织抗炎因子IL-10进行检测后发现DM组各周IL-10表达与NC组相比均较低，分析原因为在DKD初期，机体免疫平衡被打破，引起肾内皮细胞损伤、系膜细胞增生使细胞因子释放增多、炎细胞浸润，抑制抗炎因子释放从而引起IL-10表达降低。

目前对于DKD的造模方法较多，如从动物种类的选择、不同STZ的剂量、造模时间、成模标准判断等方面均有较大差异，这种差异往往会影响模型的成功率和可重复性。Abdelrahman等[12]将雄性SD大鼠腹腔注射STZ 65 mg/kg，注射7小时后尾静脉测随机血糖大于20 mmol/L为DM模型，并且与对照组相比STZ诱导DM大鼠体质量下降、UACR增加，肾脏形态学改变为肾小球系膜细胞轻度增加，肾小管上皮明显空泡变性，局灶肾小管坏死。Mensah等[13]则将Wistar大鼠一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg诱导DM模型，于1月和8月进行观察发现与正常对照组相比体质量均降低，光镜下形态学1个月时肾小管扩张，8个月时炎细胞浸润、肾小管损伤及胞浆染色丢失。由于目前国内外对DKD动物模型建立标准尚缺乏统一性，经常将DM模型成功后默认为DKD模型进行后续研究，这是欠妥的。另外根据Mogensen分期标准：UACR和肾脏病理的形态改变是DKD分期的关键，因此监测血糖、UACR和肾脏病理对DKD模型的建立至关重要。本研究的意义在于从不同时期观察高糖高脂联合小剂量STZ诱导的DM动物模型，动态监测SD大鼠一般状况、血生化指标、肾脏病理改变，对DKD模型的标准化与规范化提供可视化数据，因此我们从价格、可操作性、模型成功率、成模标准等方面考虑，建议对于DKD模型评判从8周开始检测肾脏损伤临床指标如尿微量白蛋白和12周进行肾脏病理的观察，从而进行更准确地对DKD模型进行评判。

DKD是由DM引起的慢性肾病，病理改变以肾小球系膜增生、基底膜增厚、肾小管萎缩而导致肾小球硬化和肾间质纤维化为特征[14]。最新研究发现，在DKD发病过程中，炎症起了至关重要作用，而炎性细胞因子IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子在发病机制中具有重要作用[2，15-16]。IL-10作为抑制炎症的细胞因子来限制炎症引起的组织破坏，它主要由Th2细胞、调节性T细胞、单核巨噬细胞分泌[17]。有研究发现DKD患者外周血中IL-10水平升高，并且Il-10与蛋白尿呈正相关，这提示IL-10水平的升高似乎与DKD患者严重程度有关[18]。另有研究显示与正常对照组相比，IL-8、IL-10水平增高随着DKD严重程度增加而增加，IL-10水平增高在一定程度上提示了DKD和炎症有关[19]。Guo等[20]发现STZ诱导DKD大鼠模型中IL-10、IL-4水平降低，而IL-12、干扰素(interferon，INF)-γ、INF-α水平升高，用雷公藤内酯处理DKD大鼠后发现IL-10水平增加。我们通过观察发现不同时间DM组大鼠IL-10水平均低于NC组，进一步提示炎症在DKD发病机制中起一定的作用。

本实验还存在一些局限性：(1)考虑到大鼠和人类在基因上的差异，DKD动物模型并不能完全与人类DKD病理改变一致；(2)本实验造模时间短，DM组并没有出现典型的DKD肾脏病理改变，还需要进一步延长造模时间及动态检测IL-10水平的变化；(3)所使用的样本量较小，这可能在结果统计上存在差异，仍需进一步扩大样本量验证本研究结果。

综上本实验表明高糖高脂联合小剂量STZ建立DKD模型8周出现明显尿微量白蛋白尿和12周出现肾小球基底膜轻度增厚、肾小管上皮细胞空泡变性等病理改变，同时肾组织IL-10表达降低进一步论证IL-10参与DKD发病并有可能作为DKD治疗的靶点。