用3AB-ELISA鉴别猪口蹄疫病毒感染与疫苗免疫猪的研究

摘  要：选择大肠埃希氏菌口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）与3AB多肽非结构蛋白为主要抗原物质，选择过氧化氢-四甲基联苯胺为底物溶液，以A-G蛋白-辣根过氧化物酶为酶结合物质，对猪口蹄疫病毒感染和疫苗免疫猪进行3AB-ELISA鉴别试验。采用相关试验方法对采集自健康猪、人工感染FMDV的猪和FMD疫苗免疫猪的867份血清进行检测，3AB-ELISA对健康猪血清检测的特异性为97.63%，对疫苗免疫猪血清检测的特异性为98.90%，由此表明使用3AB-ELISA方法鉴别FMDV感染猪和疫苗免疫猪的效果佳，用3AB-ELISA来鉴别猪FMDV感染和疫苗免疫猪相较于VIAA-AGID检验法检测效率高，且操作过程以及方法更为简单，是有效的鉴别方法。

关键词：3AB-ELISA;口蹄疫病毒;I-ELISA;疫苗免疫猪

中图分类号：S851.34 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2020）03-0038-02

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）为动物A类烈性传染疾病，主要侵害偶蹄动物。如果动物受到感染，必然会严重影响畜牧业的发展、农产品的销售以及养殖人员的经济收入，甚至还会影响国家经济、国民生计和人民的健康[1]。口蹄疫病毒（Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV）属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，已知共有7个血清型。最容易感染FMDV的动物包括猪、牛和骆驼等，FMDV非结构蛋白（Non Structural Protein，NSP）特异性抗体一般被用来证明宿主已经受到感染或者正在遭受感染[2]，且非结构蛋白（NSP）与结构蛋白不同，不存在血清类型的区别。根据曾发表过的动物感染FMDV和免疫鉴别结果，3ABC抗原作用于抗原的效果显著，但一些针对牛的检测结果表明，小部分免疫动物出现3A抗体，这很有可能是因为疫苗制作时残留了极少量的3A蛋白，从而一定程度上影响了3ABC和3AB检测的特异性。I-ELISA使用FMDV非结构蛋白（NSP）3ABC多肽为主要抗原物体，能鉴别FMDV抗体和接种灭活疫苗后产生的免疫抗体的效果值得肯定，但是用此种方法检测猪血清的特异性相对较低。白银市农业科学研究所建造了一种新型3AB多肽，和3ABC多肽I-ELISA相比对牛血清检测的敏感性差异较小，同时提高了猪血清的敏感度。

1  材料和方法

1.1 材料

选择VDPro FMDV非结构蛋白（NSP）抗体检测试剂盒，试剂盒中有：FMDV及NSP蛋白包被板（FMDV 3AB Coated Plate）5块，HRP酶标抗体（HRPO Anti-FMDV NSP Conjugate）70 mL，H2O2-TMB底物液（TMB substrate）70 mL，抗原物FMDV-3AB多肽和H2SO4终止液各1瓶。

1.2 待检猪血清

1.2.1 经过检测合格的猪血清

从近段时间以来从未出现过口蹄疫疫情且从未采取免疫措施的地区收集健康猪血液样本396份，其中243份来自FMDV抗体为阴性的健康猪，153份样本来自之前接种过疫苗的健康猪。健康猪血进行血清分离，试验时选用ELISA对其进行检测。

1.2.2 人工感染FMDV猪血清

选择体质合格的18头健康猪，用FMDV对其进行人工感染，约半年后采集血液，采血样本为18份，随后进行血清分离。

1.2.3 FMDV免疫豬血清

选择453头FMDV抗体检测阴性的猪接种FMDV灭活疫苗，免疫后30 d～60 d采集血液样本，随后进行血清分离。

1.3 检测

1.3.1 试验前准备

根据试剂的说明书进行操作，试剂盒需储存于2 ℃～8 ℃的环境中。试验前将洗液稀释10倍，如洗液20 mL，则需加入180 mL离子水;准备TMB底物，由于低温会降低显色程度，在使用前将其恢复到室温。

1.3.2 检测过程

保证试剂盒中的所有组件的温度均已恢复到室温（22 ℃～28 ℃），取出试剂盒中的抗原包被板;对样本、阴性对照和阳性对照做好标记，两种对照标记均做两孔，每孔倒入稀释液约80 μL，之后分别倒入20 μL血清、阴性对照和阳性对照，摇晃混匀，于室温环境下放置1 h，洗净控干;倒入100 μL酶标抗体混合物，于室温环境下放置1 h，洗净控干;倒入100 μL底物反应液，于室温环境下放置1 h，洗净控干，倒入100 μL终止液。

2  结果

2.1 健康猪血清

用3AB-ELISA法检测396份检验合格的健康猪血清，经过统计，3AB-ELISA的抗体临界值为0.339。在396份健康猪血清样本中，9份猪血清的OD450 nm值不在临界值内，占全部健康猪血清的2.27%，用3AB-ELISA法检测健康猪血清的特异性是97.63%。

2.2 人工感染猪血清

用3AB-ELISA法检测18份人工感染猪的血清，OD450 nm值为0.911±0.293。

2.3 FMDV免疫猪血清

用3AB-ELISA法检测453份免疫猪的血清，OD450 nm值是0.174，临界值0.381。在453份免疫猪血清样本中，5份猪血清的OD450 nm值不在临界值内，占全部免疫猪血清的1.10%，使用3AB-ELISA法对FMDV免疫猪血清检测的特异性是98.90%。

3  结论

用3AB-ELISA法检测易受FMDV感染的猪的血清鉴别效果较好，可用来鉴别动物的感染程度和是否受到感染情况。每次试验需做好2孔阴性对照和阳性对照。使用3AB-ELISA法进行检测鉴别时，在排除材料的非特异性情况下[3]，如果OD450 nm值≥0.40，则证明FMDV感染，在对偶蹄动物进行检疫时，应严格选取OD450 nm值<0.376检测标准进行检疫。

参考文献：（3篇;略）

作者简介：马娇莉（1988.12- ），女，甘肃靖远人，本科，助理兽医师，主要从事畜牧兽医技术推广和动物疫病防控与动物卫生监督工作