脓毒血症患者血清IncRNA H19与TNF-ɑ IL-1β及IL-6等促炎因子水平相关性分析

俞振飞 张美齐 吴微华 许志阳

脓毒血症（Sepsis）是一种由于感染或创伤导致的微生物入侵引起全身炎症反应的临床急症，其中重度脓毒血症可导致患者全身重要组织器官损害甚至死亡［1］。当患者出现休克症状时死亡率达30%~70%［2］。研究表明脓毒血症的发病机制涉及血液高凝状态，炎症失控，毛细血管渗漏增加心脏负荷等，其发病引发全身性炎性网络效应，而控制患者全身炎症反应是逆转脓毒血症恶性发展的关键［3］。近年来已发现，非编码的微小RNA（miRNA）与脓毒血症的发生、发展密切相关。有研究显示16SrRNA、miRNA-21 在脓毒血症患者的外周血中存在稳定的差异性表达，在控制炎症方面为临床治疗脓毒血症提供新方向［4］。而关于通常碱基序列>200b 的长链非编码的RNA（IncRNA）与脓毒血症的关系尚不清楚［5］，现研究已证明IncRNA H19 是一种较活跃的调控因子，对肿瘤细胞增殖、迁徙等均有调制作用，因此本文对IncRNA H19 在脓毒血症患者血清中的表达进行检测，研究其与促炎因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 的关系，以探讨血清IncRNA H19 在脓毒血症治疗中的价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016 年12 月至2018 年12 月本院收治的脓毒血症患者120 例，诊断标准符合2001年美国危重病医学会和欧洲危重病医学会制定的关于全身性感染定义和标准，其中呼吸道感染44 例，泌尿系统感染31 例，血源性感染37 例，消化系统感染28 例，其他20 例。排除标准：放弃治疗或死亡的患者，合并肿瘤或自身免疫性疾病，心源性疾病等。根据 APACHEII 评分标准将收治的病例患者分为轻度脓毒血症组（9~14 分），重度脓毒血症组（>15 分，包含严重和休克性脓毒血症）［6］。轻度脓毒血症组患者73 例，男33 例，女43 例；年龄23~79 岁，平均年龄（53.22±11.23）岁。重度脓毒血症组患者47 例，其中男22 例，女25 例；年龄26~87 岁，平均年龄（51.29±9.67）岁。本研究经医院伦理委员会批准，获患者或家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法 （1）样本收集：收集所有脓毒血症患者入院24h 及平稳恢复期血液样本，以及健康受试者血液样本于含肝素的抗凝管中。在1h 内1200r/min 离心5min，收集上清液置于-70℃冰箱内待检。（2）Realtime PCR：每0.75ml Trizol 试剂混匀至0.25ml 血清样本中，提取血清总RNA，取2μg RNA，应用德国Qiagen公司的逆 转录试剂盒按20μl 逆转录体系合成cDNA。PCR 引物应用软件Primer5.0 设计，由上海吉玛合成，以 GADPH 作为内参对照，引物序列：IncRNAH19 引物序列如下：上游'5-TTCAAAGCCTCCACGACTCT-3'，下 游'5-GCTCACACTCACGCACACTC-3'；GAPDH 上游5'-CG-GAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3'， 下 游5'-AGC-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。荧光定量PCR 反应体系为25μl，内含500ng cDNA 模板，终浓度为 250nmol/L 的上下游引物及SYBRGreen Realtime PCR Master Mix 12.5 txl。每个样本的表达含量以GADPH 为参照。引物序列反应条件为：95℃60s，95℃15s，退火15s，72℃45s，荧光收集，40 个循环［7］。每个样本重复3 次。以相对CT 值（2-△△Ct）表示目的基因的相对表达量，以空白组作为对照。

1.3 观察指标 在患者入院后第2 天早晨6 点空腹抽取静脉血5ml，离心后取上清液，置于-20℃保存，酶链免疫吸附试验（ELISA）检测血清测定促炎因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6，试剂盒均购于上海康朗生物科技有限公司。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0 软件。计量资料以（±s）表示，多组间比较采用方差分析。相关性分析采用双变量Pearson 相关性分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脓毒血症患者与健康者受试者血清lncRNA H19的表达情况 入院24h 急性期脓毒血症患者中lncRNA H19 的相对表达含量高于健康组，差异有统计学意义（P<0.05）。而患者平稳期的血清lncRNA H19 表达量较急性期含量下降（P<0.05）。见图1。2.2 轻度和重度脓毒血症组患者血清lncRNA H19 的表达情况 入院24h 急性期重度脓毒血症患者lncRNA H19 的相对表达含量显著高于轻度组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图2。

图1 健康者和脓毒血症急性期及恢复期患者的血清lncRNA H19的表达

图2 轻度组和重度组中血清中lncRNA H19的表达。

2.3 三组患者入院24h 急性期血清各指标水平比较 与健康对照组患者比较 轻度和重度脓毒血症组患者IL-1β，TNF-ɑ，IL-6 水平均升高（P<0.05）；与轻度脓毒血症患者相比，重度脓毒血症组患者IL-1β，TNF-ɑ，IL-6 水平均升高（P<0.05）。见表1。

表1 三组患者急性期血清各指标水平比较（±s）

表1 三组患者急性期血清各指标水平比较（±s）

注：与健康对照组比较，*P<0.05；与轻度脓毒血症组比较，#P<0.05

分组 IL-1β（pg/ml） TNF-ɑ（ng/ml） IL-6（pg/ml）轻度脓毒血症组 121.09±9.43* 82.65±5.36* 186.79±8.12*重度脓毒血症组 146.77±16.01*# 101.36±6.59*# 246.65±18.19*#健康对照组 68.24±11.51 57.90±4.38 63.21±9.56

2.4 血清IncRNAH19 水平与脓毒血症患者血清各指标相关性分析 入院24h 脓毒血症患者IncRNA H19血清水平与IL-1β、TNF-ɑ，IL-6 水平呈正相关性（P<0.05）。

表2 急性期患者血清IncRNAH19水平与脓毒血症患者血各指标相关性

3 讨论

脓毒血症是临床常见的危急重症，具有病情发展迅速、病死率高及预后差等特点［8］。全身炎症反应是患者脓毒血症进展迅猛的关键因素［9］。脓毒血症在疾病发展早期就造成炎症反应激活，产生大量炎症因子释放入血，反馈机体又形成更强烈的炎性反应［10］。而脓毒血症患者在内毒素或损伤因素作用下加快促炎因子的释放造成内皮细胞损伤及通透性的改变造成毛细血管渗漏，当毛细血管渗漏会进一步使患者全身水肿造成心脏负担的增加［11-12］。因此脓毒血症的发生发展与机体的炎症反应存在密切联系。

以往研究认为非编码RNA 虽占据基因组的大部分而并不具备有生物学功能，视其为转录“噪音”，而随着近年来对人类基因组的不断研究，非编码RNA的作用越发被熟知。其广泛参与肿瘤、遗传、炎症等机体重要生命活动过程［13-14］。有学者发现脓毒血症患者外周血中miR-21、miR-148a 等表达上调，而16SrRNA、miR-138 表 达 下 调［15］。提 示 非 编 码 微小RNA 参与脓毒血症的发生发展过程，但长链非编码RNA 对于脓毒血症的作用研究尚处于起步阶段，IncRNA H19 作为长链非编码RNA 被熟知，是由于其作为癌基因和抑癌基因的分子身份［16］，其在肿瘤的发生发展中起双刃剑的作用［17］，IncRNA H19 可通过与多种微小RNA 作用调控胚胎发育、代谢过程［18］，但关于IncRNA H19 与脓毒血症的发生、发展关系研究尚少［19］，本研究通过对120 例脓毒血症患者的外周血清进行Real-time PCR 检测表明，在脓毒血症组患者的IncRNA H19 表达显著高于健康对照组（P<0.05），且患者恢复期IncRNA H19 的表达显著下降（P<0.05），提示IncRNA H19 与脓毒血症的发生发展有关，有望成为治疗脓毒血症新的靶向基因。

当机体受到感染时，TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 等细胞促炎因子由单核巨噬细胞和淋巴细胞诱导产生，参与机体炎症反应，以上提及的促炎因子的血清浓度与机体炎症反应呈正相关［20-21］；本资料结果表明，与健康对照组相比，在脓毒血症患者住院24h 急性期时，重度脓毒血症患者TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 明显偏高，TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 水平的总体趋势是健康对照组<轻度脓毒血症组<重度脓毒血症组。通过RealtimePCR 验证患者血清中IncRNA H19 的实际表达量，相关性研究发现促炎因子TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 升高与血清IncRNA H19 水平有相关性，证实脓毒血症患者IncRNA H19 与促炎因子形成的炎症反应可能存在密切关系，为潜在的脓毒血症机体炎症反应的靶点。

脓毒血症临床较为常见，病情迅猛及病死率高，因此及时规范治疗尤为重要。本研究通过对脓毒血症患者血清中IncRNA H19 的监测发现，血清中IncRNA H19 与脓毒血症患者促炎因子密切相关，其对于脓毒血症的治疗可能具有一定的临床意义，但还需进一步揭示IncRNA H19 表达与脓毒血症严重程度的相关性的具体机制，以期获得脓毒血症炎症控制的新思路。