2019新型冠状病毒的抗原抗体检测

高 原， 陈 川， 王 晶

(中国计量科学研究院，北京100029)

1 引 言

目前2019冠状病毒病(COVID-19)在全球范围爆发，这是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2)入侵人体引起的一种急性呼吸道传染病。SARS-CoV-2是目前发现的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种为人冠状病毒229(HCoV-229)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)[1]。

针对COVID-19的诊断，首先主要集中于病毒核酸的检测，即基于聚合酶链反应(PCR)的核酸检测，已成为SARS-CoV-2检测的金标准[2,3]。病毒核酸检测过程对实验室环境、检测人员、仪器要求比较高；并且通常需要对鼻拭子、咽拭子、肛门拭子进行采样[4]，采样人员在操作过程中需严格控制感染风险。目前疑似病例数量较多，如果只靠病毒核酸检测来进行诊断，其工作量太大；并且由于样本采集手法、样本保存条件、PCR操作过程等因素，可能导致假阴性和假阳性结果的出现。增加SARS-CoV-2抗体、抗原检测的方法来进行辅助诊断，与核酸检测手段相互补充，可弥补核酸检测时出现的假阴性和假阳性，以提高疑似病例检测的准确率。

目前许多企业相继推出了基于免疫学诊断的新冠病毒抗体检测和抗原检测试剂盒，抗体检测试剂盒居多。中华人民共和国国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(第7版)》中增加了通过检测新冠病毒蛋白特异性抗体检测来辅助新冠肺炎的临床诊断。

本文将对新冠病毒抗体检测和抗原检测的免疫分析方法重点进行分析。

2 免疫反应

新型冠状病毒入侵人体后，病毒本身携带的蛋白具有抗原活性，会刺激人体免疫细胞产生的抗体来抵抗病毒，先是抗体免疫球蛋白M(IgM)，然后会是抗体免疫球蛋白G(IgG)等。通过免疫分析技术可以检测人体内是否存在病毒携带的蛋白(抗原)和由于病毒入侵产生的抗体。

2.1 抗体检测

在病毒入侵人体后，其相应的抗原决定簇与淋巴细胞接触将诱导淋巴细胞分泌产生特异性抗体，包括5类免疫球蛋白，分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。

抗体检测则是通过特定的抗原与待检样品中产生的抗体发生免疫反应从而实现对样品中的抗体进行检测。患者被感染病毒后产生免疫反应，会产生抗体。相关研究表明，通过对患者血液中IgM和IgG的表达水平进行检测，可以对COVID-19进行诊断[5,6]。检测包括了对血液中IgM和IgG单独检测和对两者进行联合检测[7]。与核酸检测相比，抗体检测更适用于对新冠病毒核酸检测呈阴性的疑似病例进行补充检测。抗体检测结果可帮助识别患者的感染情况：早期感染，IgM抗体呈现阳性；当感染有一段时间，如超过7 d(或既往感染)，IgG抗体显现阳性，一定时间范围内，其持续时间越长含量越高[7,8]。

获得可以识别抗体的抗原或抗抗体是抗体检测的关键，通常使用重组蛋白技术。Zhang等[9]用2019-nCoV包膜蛋白E和核衣壳蛋白N作为抗原来对血清中IgM和IgG进行免疫分析。由于冠状病毒的核衣壳蛋白(NPs)具有高度的同源性， Zhou等[5]成功使用蝙蝠SARSr-CoV Rp3核衣壳蛋白(NP)作为抗原，通过酶联免疫吸附技术对患者的IgG和IgM抗体进行检测。Cai等[10]则从GenBank(NC_045512.1)基因组序列中推断合成出20种肽被作为候选抗原，再通过免疫分析从中选择合适的肽段，用于新冠病毒抗体检测。重组抗原技术相对于抗体制备更容易，所以抗体检测方法研发周期相对更短。

2.2 抗原检测

抗原检测是基于抗体与样本中病毒携带的蛋白质产生免疫反应，通过对感染部位的取样进行免疫分析从而对COVID-19进行判断。抗原检测的关键是制备适用于抗原检测的抗体，包括单克隆抗体和多克隆抗体。大多数抗体必须利用免疫动物产生免疫反应获得，制备过程相对繁琐耗时。

新型冠状病毒是属于冠状病毒科的单条正链RNA病毒，同其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2包含了核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)、刺突糖蛋白(Spike protein，S)、包膜蛋白(Envelope protein，E)和膜蛋白(Membrane protein，M)[1,11]。S蛋白是该病毒入侵人体细胞的关键，通过S蛋白上的受体结合域(RBD)与宿主细胞的血管紧张素转化酶2(ACE2)产生特异性结合，从而介导病毒进入宿主细胞[12]。Lei等[13]将ACE2的变体与人免疫球蛋白G进行重组，所得到的融合蛋白可以与SARS-CoV-2结合。

SARS-CoV-2与SARS-CoV的S蛋白上的受体结合域具有相对较高的同源性，有研究发现抗SARS-CoV人单克隆抗体CR3022可以与SARS-CoV-2有效结合[14]。

可以与SARS-CoV-2有效结合的蛋白，具有被应用于抗原检测的潜力，对特异性抗体的制备具有非常重要的意义。此外，SARS-CoV-2的核衣壳蛋白(NPs)在所有7种冠状病毒之间有非常高的同源性共享。Li 等[11]通过已报道的NP序列，利用小鼠和新西兰兔制备了相应的单克隆抗体和多克隆抗体，用于SARS-CoV-2的抗原检测。

2.3 抗体和抗原检测试剂盒

不少企业相继推出了基于免疫学分析的SARS-CoV-2抗原抗体检测试剂盒，使用试剂盒可以使检测过程更加简便、快速、标准化。抗原抗体检测试剂盒包括了IgG抗体检测试剂盒、IgM抗体检测试剂盒、IgG/IgM联合抗体检测试剂盒以及抗原检测试剂盒。

IgM与IgG的检测有助于对病毒感染阶段进行判断。研究发现测量IgG和IgM总抗体量具有比单独测量单种抗体的测量结果具有更高的阳性率，减少了检测过程中假阴性的概率[7]，IgM、IgG检测可以显示病毒感染的不同阶段。而抗原试剂盒直接对感染部位病毒蛋白进行检测，不同种类的试剂盒的检测结果可提供不同阶段的有效信息。

截至2020年3月31日，中国国家药品监督管理局应急审批新冠病毒检测试剂产品25个，其中抗体检测试剂盒8个。

3 免疫分析方法

不同厂家生产的抗体检测和抗原检测试剂盒用到的免疫分析方法不尽相同，有酶联免疫吸附技术、胶体金免疫技术、荧光免疫层析技术和磁微粒化学发光技术等。不同的分析方法可能用到不同的免疫分析方法、测量技术，从而造成检测性能有所差别。

3.1 酶联免疫吸附技术

酶联免疫吸附技术是最常用的一种免疫分析方法，将酶催化反应与免疫反应结合，包括了双抗夹心法、两位点一步法、间接法测抗体、竞争法、捕获法；其原理是将酶分子与抗体(抗原)分子共价结合，然后将酶标记的复合物与吸附在固相载体上的抗原或抗体接触反应，发生特异性结合，最后加入酶的反应底物，根据底物的颜色反应进行定性和定量分析；其检查结果可通过肉眼观察颜色或使用酶标仪进行吸光度测量来判断。SARS-CoV-2抗原抗体检测主要用到双抗原(体)夹心法、间接法和捕获法[5,8,15]。

双抗原夹心法进行抗体检测时，使用含有SARS-CoV-2的S蛋白的受体结合域的哺乳动物细胞表达的重组抗原与过氧化物(HRP)偶联，用于和样本中的目标抗体结合，然后再与和固定相连接的抗原结合，最后在反应体系中加入酶催化底物，底物的颜色反应作为检测结果[8]。抗原检测时，只需将HRP偶联抗原与固定相结合抗原换成可与病毒抗原结合的抗体，即双抗体夹心法。

间接法主要用于抗体检测，只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。捕获法又称反向间接法，多用于IgM的检测，先将针对IgM的第二抗体包被与固相载体形成固相抗体；加入待测标本时，其中IgM类抗体(特异和非特异的)即可被固相抗体捕获；再加入特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标记特异性抗原的抗体，形成固相二抗-IgM-抗原-酶标记抗体复合物；加底物显色后，即可对待测标本中IgM是否存在及含量进行测定[8]。

酶联免疫吸附技术特异性较强，不需要特殊的仪器就可以进行定性检测，通过酶标仪进行吸光度测量还可以在一定程度上进行定量检测；但是其人工操作步骤相对繁复，将影响整体的检测速度[15]。

3.2 胶体金免疫技术

胶体金免疫技术利用金颗粒的高电子密度特性，以胶体金作为示踪标记物应用于免疫分析，胶体金标记实质上就是将蛋白质等高分子吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。

胶体金免疫技术包括有免疫胶体金光镜染色法、免疫胶体金电镜染色法、斑点免疫金渗滤法、胶体金免疫层析法。目前SARS-CoV-2抗体检测试剂盒主要使用的方法为胶体金免疫层析技术[15]，包括已批准的IgM、IgG抗体检测试剂盒。

胶体金免疫层析技术间接法检测抗体过程如图1所示，金标垫上吸附有胶体金标记的特异性抗原I,检测区(T线)上固定的是特异性抗原Ⅱ，质量控制区(C线)上固定有抗特异性抗原Ⅰ的抗体。样品滴入样品垫，待测抗体经过金标垫，形成的抗体-金标记抗原在T线与抗原Ⅱ结合，游离的金标记抗原Ⅰ继续向前到达C线与抗抗体结合，最后T线和C线将发生不同程度的颜色变化。抗原检测则将金标记的抗原Ⅰ与检测区固定的抗原Ⅱ换成可与病毒抗原结合的特异性抗体即可。该技术现已发展成为诊断试纸条的形式，使用十分方便。

图1 胶体金免疫层析检测抗体过程示意图Fig.1 Colloidal gold immunochromatography detection process

在对新型冠状病毒进行抗体检测时，使用静脉全血、血清或血浆样品与稀释剂混合，直接添加到样品垫，等待10～15 min，就可以通过测试条上测试线与对照线的颜色来判断结果。测试条和对照线都变为红色为阳性；测试条不变色、对照条为红色，则为阴性[15]。

胶体金免疫技术操作简单，不需要额外的仪器便可进行定性分析，可以对IgG和IgM进行综合检测或单独检测；与操作相对繁琐的酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA) 相比更具优势，并且反应迅速；但是这种技术的灵敏度比较差，无法进行定量检测。目前已有4个企业的胶体金免疫层析分析的试剂盒被应急审批上市，适用于对临床疑似病例进行快速筛查，特别是对于无其他免疫分析所需要的配套检测仪器的地方。

3.3 荧光免疫层析技术

荧光免疫层析技术采用荧光物质作为示踪标记物，用于标记特异性抗体(或抗原)，再与待测的抗原(或抗体)结合，通过荧光检测仪检测其特异性荧光反应。根据荧光标记物种类的不同可分为荧光素免疫荧光层析技术、量子点免疫层析技术、上转换纳米粒子免疫层析技术。

荧光免疫层析技术的免疫反应过程与胶体金免疫层析技术一样，只是用荧光标记物代替了胶体金进行颜色反应。与传统胶体金标记的免疫层析技术相比，荧光免疫层析技术通过仪器直接检测激发荧光信号进行测量，这种检测方式具有较高的灵敏度，有利于进行准确定量；并且与酶催化显色技术相比，避免了催化效率及底物量限制的问题，具有更宽的检测范围。

荧光免疫层析技术相对于酶联免疫吸附技术和胶体金技术分辨率更高，检测范围更宽。虽然需要荧光分析仪进行测量，但与磁微粒化学发光技术相比所需要的试剂成本和仪器成本更低，特别是上转纳米粒子免疫层析技术，使用时间分辨荧光分析仪，拥有接近化学发光的分辨率[7]，可以进行准确的定量。

3.4 磁微粒化学发光免疫技术

化学发光免疫技术将化学发光与免疫技术结合，化学发光物质吸收化学能从基态变成激发态，再从激发态释放光能回到基态，发出的光子被发光信号检测仪器接收从而对化学发光物质进行测量。化学发光免疫技术通过将化学发光物质或催化化学物质发光的酶标记在抗原或抗体上，作为示踪标记物对抗原或抗体进行检测。

磁微粒化学发光免疫分析技术综合了磁微粒载体技术和化学发光免疫检测技术。利用磁微粒作为固相载体，得到更高的比表面积，以及外加磁场的应用，可获得更高的灵敏度和更快的检测速度。目前8个被批准的抗体检测试剂盒中有2个是应用了磁微粒化学发光免疫技术。

磁微粒化学发光免疫技术灵敏度高、特异性强、检测范围宽，通过相对发光强度(PLV)来表征测量结果。目前已有比较成熟的全自动化学发光免疫分析仪，便于实现自动快速测量，可以准确地对IgG、IgM进行区分测量，对患者IgG与IgM水平实现追踪检测，从而可以更加准确地区分COVID-19与其他一些疾病。但是其试剂成本较高，需要借助特定的化学发光仪才能进行测量，比较适用于重度感染地区的医院、疾控机构等有大量患者需要准确定量检测的地方[9]。

4 讨论与展望

病毒的免疫诊断技术包括抗体检测和抗原检测，都是基于免疫反应进行检测。抗原检测需要制备与病毒蛋白特异性结合的抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)，常通过免疫动物制备，制备过程比较复杂，耗时较长。抗体检测需要可以与免疫反应产生的抗体相结合的抗原，而重组抗原的表达纯化技术相对于抗体的免疫采集纯化，技术相对简单、时间周期相对较短；因此，目前研制成功的新冠病毒抗体检测试剂盒的数量远多于其抗原检测试剂盒，被批准上市的免疫诊断试剂盒也都是抗体检测试剂盒。但是，患病初期血清中没有可检测到的抗体，所以抗体检测无法对该阶段的感染者进行筛查；这时想要通过免疫学方法筛查，需要使用抗原检测，尽快研发并批准可用于临床诊断的抗原试剂盒变得非常重要。

表1给出了不同免疫分析方法的优点及其局限性。

表1 不同免疫分析方法比较Tab.1 Comparison of different immunoassay methods

目前批准的抗体检测试剂盒，基于抗体的免疫学检测存在假阳性情况，主要是由于内源性干扰物质，有相当比例的标本不同程度地含有内源性(如嗜异性抗体、补体、溶菌酶)、外源性(如标本溶血、细菌污染、标本凝固)的各种干扰物质[11]，从而导致测定结果的假阳性，因此检测试剂盒质量和检测过程的质量控制十分重要。新型冠状病毒抗原抗体检测试剂盒质量，以及建立相关的免疫分析方法的可行性和测量结果的量值溯源，需要研制相关标准物质和标准化程序进行质量控制。

目前，中国计量科学研究院已研发了满足病毒抗体和抗原检测并具有溯源性计量意义的新型冠状病毒人源IgG单克隆抗体标准物质和新型冠状病毒核衣壳蛋白溶液标准物质，对抗原抗体检测和产品的质量控制起到重要支撑作用；同时，期望最终建立应对生物安全威胁因子测量的质量控制标准体系。