Box-Behnken响应面法优选红景天苷乳剂凝胶处方工艺并研究其对烫伤的治疗作用△

李越，吴中宝，杨艳玲，胡等慧，王秀丽*

1.北京中医药大学，北京 102488；2.重庆市药物种植研究所，重庆 408435

创面是正常皮肤组织在某些外界因素的作用下所导致的损害，如高温导致的烧烫伤、机械性损害导致的皮肤创伤、低温导致的冻伤等[1]。其中烫伤发生频率不仅高，而且较机械创伤更为复杂，治疗难度大。

红景天苷(salidroside)来源于景天科植物红景天，具有抗衰老、免疫调节、清除自由基等作用，目前国内外对红景天的药理作用研究主要集中在心血管疾病、预防衰老、抗肿瘤、改善糖尿病症状、保护肺纤维化等疾病的治疗上[2-3]，暂未检索到对烫伤的治疗，但有研究表明，红景天苷可通过多种途径发挥抗炎作用[4]。目前红景天主要成分红景天苷制剂暂无外用制剂，而红景天作为传统中药，在许多典籍中均有活血通瘀、强健机体的记载。因此本研究试图开拓红景天苷的治疗领域及给药形式，将红景天苷承载于便于创面涂抹、透气、温和不刺激的乳剂凝胶，建立大鼠Ⅱ度烫伤的创伤模型，以红景天苷乳剂凝胶外敷，通过检测治疗效果，考察红景天苷对Ⅱ度烫伤的愈合作用，并探究其作用机制，为扩展红景天苷的应用范围提供参考。

1 材料

1.1 仪器

OLYMPUS BX51型显微镜(北京锐驰恒业仪器科技有限公司)；FA1204B型分析天平(上海精密仪器仪表有限公司)；电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；3-18N台式高速离心机(湖南恒诺仪器设备有限公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝科技股份有限公司)。

1.2 动物

SD大鼠，雌雄各半，体质量为200～220 g。合格证号 SCXK(京)2016-0002，购于北京斯贝福实验动物科技有限公司，饲养于北京中医药大学动物房。

1.3 试药

红景天苷乳剂、复合乳化剂(实验室自制)；京万红软膏(天津达仁堂京万红药业有限公司)；10%中性福尔马林固定液(北京益利精细化学品有限公司)；卡波姆、甘油、EGF抗体、bFGF抗体(上海源叶生物有限公司)；水合氯醛(天津市福晨化学试剂厂)；注射用青霉素钠(江西省科达动物药业有限公司)；络合碘消毒液(湖南省广盛源医药科技有限公司)；0.9%氯化钠溶液(江西科达卫生用品有限公司)。

2 方法与结果

2.1 红景天苷乳剂的制备

将处方量油相中加入复合乳化剂，超声使其分散均匀，水浴60 ℃保温，作为油相溶液；另取处方量红景天苷溶于纯水中，溶解后60 ℃保温，作为水相溶液；两相均保温至60 ℃时，立即将水相加入至油相中，搅拌得初乳，置于高速均质分散机中，11 000 r·min-1均质5 min即得终乳。

2.2 红景天苷乳剂凝胶的制备

称取卡波姆与甘油适量，研匀后充分溶胀；取2.1方法下制成的红景天苷乳剂10 mL，稀释后滴加至溶胀的凝胶中；调整pH，并加溶胀液至100 g，搅匀，于4 ℃密闭贮存。

2.3 红景天苷乳剂凝胶的处方工艺优化

2.3.1乳剂凝胶成形评分标准 以凝胶的外观、延展性、均匀度、离心性的综合评分为考察指标，筛选适宜的凝胶制备处方[5-6]。评分标准见公式(1)，具体评分标准见表1。

综合评分(100分)=外观评价(25分)+ 延展性(25分)+均匀度(25分)+离心性(25分) (1)

2.3.2Box-Behnken响应面法优化处方工艺 根据2.2的制备方法制备乳剂凝胶，对卡波姆的用量、乳剂用量、甘油用量及pH等因素进行考察。预实验结果发现，对乳剂凝胶的理化性质影响较大的3个因素分别是卡波姆用量、甘油用量及pH。因此，本研究将卡波姆用量(A)、甘油用量(B)、pH(C)3个因素设为自变量，以乳剂凝胶成形综合评分Y为评价指标，考察各因素对乳剂凝胶的影响，每个因素选取低、中、高3个水平，设计因素水平见表2，实验安排及结果见表3。

表2 乳剂凝胶处方筛选设计试验因素与水平

表3 Box-Behnken响应面法优选红景天苷乳剂凝胶 处方工艺试验设计及其结果

2.3.3模型拟合 采用Design-Expert 对上面数据进行分析，以Y对自变量进行模型拟合，并通过r等对拟合模型进行评价，通过比较各拟合方程的拟合度，得到二次多项式回归方程Y=81.40-11.12A+9.13B+1.50C+2.00AB-2.75AC-1.25BC-1.95A2-0.45B2-18.20C2，r=0.991 3，P<0.001，F=88.15，表明模型差异有统计学意义；失拟项P=0.345 1>0.05，失拟项不显著，说明该模型拟合度和可信度均有效，试验误差小，可以用此模型对红景天苷乳剂凝胶的处方优化进行分析和预测。具体结果见表4。

表4 二次多项式方程模型方差分析

2.3.4响应面优化分析 根据拟合方程，通过Design-Expert 8.0.6软件绘制评价指标综合评分随因素变化的等高线图和响应面图，具体结果见图1～6。

图2 卡波姆用量-甘油用量响应面图

图3 卡波姆用量-pH等高线图

由图1和2可以看出，卡波姆用量和综合评分呈负相关，甘油用量和综合评分呈正相关，即随着卡波姆用量的减少和甘油用量的增加，综合评分在一定范围内增加；由图3和4可以看出，pH对综合评分的影响成抛物线形，即随着pH的升高，综合评分呈先增大后降低的趋势，但pH对于综合评分的影响差异无统计学意义；由图5和6可以看出，在选定范围内的pH对于综合评分几乎没有影响，但随着甘油用量的的提高，综合评分达到最大值，当甘油用量继续升高时，综合评分缓慢降低。因此，在实际生产中应控制pH在最佳范围。

图4 卡波姆用量-pH响应面图

图5 甘油用量-pH等高线图

图6 甘油用量-pH响应面图

2.3.5响应面预测和验证 利用Design-Expert 8.0.6版软件优化处方，得到红景天苷乳剂凝胶的最优处方：卡波姆用量为0.5%，甘油用量为15 g，pH为6.5，此时综合评分为97.37分。按照优化的处方剂量制备3批红景天苷乳剂凝胶样品进行综合评分，与预测值的RSD<5%，说明所得实验结果重现性好，制备工艺稳定。

2.4 大鼠Ⅱ度烫伤药效实验

2.4.1造模及给药 将大鼠常规饲养3 d后，用剃毛刀剃去背部长毛，再涂上脱毛膏，3 min后脱去后背部区域的毛发，温水清洗拭干，适应喂养24 h，避免大鼠背部皮肤对脱毛膏过敏。实验组大鼠用10%水合氯醛麻醉[用量0.3 mL·(100 g)-1]，用乙醇消毒脱毛区域，然后在背部脊柱左右两边各1 cm处，以自制的直径18 mm的离心管注入15 mL 100 ℃热水，在大鼠背部持续烫8 s，制成对称的2个圆形深Ⅱ度烫伤创面[7-8]，术中注意保暖，大鼠侧身放置，避免大鼠窒息死亡。

造模成功后，将大鼠随机分为3组，大鼠烫伤模型组(A组)：常规饲养，不给药，涂碘伏消毒；乳剂凝胶组(B组)：给予红景天苷乳剂凝胶外敷，每天1次；阳性药组(C组)：常规饲养，给予京万红软膏外敷，每天1次，每个烫伤创面用量约为0.05 g·min-1。每组大鼠在3、6、11、15、21 d观察状态并取材。

2.4.2大鼠形态观察 于烫伤造模后大鼠复苏时肉眼观察，并于烫伤后1、3、6、9、11、15、21 d观察创面状态，记录渗出物、感染、结痂红肿等情况，并拍照。

实验结果显示，大鼠背部皮肤烫伤后，烫伤面为白色，小部分为紫红色，有轻微水肿，烫伤面质地变硬，无感染现象。烫伤面肉眼观察符合烫伤后深Ⅱ度烫伤的外观表现。在后续观察中，各组均有不同程度的愈合，其中模型组恢复最慢，直至给药后第11 d才有较明显愈合趋势；给药组恢复效果较好，给药后第6天，给药组烫伤面已经开始脱痂；给药后第15天，给药组烫伤面细皮较多，且未再次形成痂皮；给药后第21天，乳剂凝胶组大鼠背部烫伤面己完全被上皮覆盖，毛发生长较多，皮肤组织及功能均已恢复正常，阳性药组大鼠背部烫伤面大部分已愈合，但仍有小部分烫伤面的痂皮未脱落，且皮肤有轻微癣痕，而模型组烫伤面仍有较为明显的烫痕，且愈合率较低。

2.4.3烫伤创面愈合率 用透明硫酸纸描下烫伤轮廓，将所描的透明硫酸纸剪下，然后用万分之一天平称定其质量，以质量代替面积。将烫伤造模后1 d的面积作为原始面积，计算烫伤6、11、15、21 d的愈合率，具体结果见表5。与模型组相比，给药3 d后，各组大鼠烫伤面面积无明显变化；在第6、11、15、21天烫伤面愈合率明显增加，且差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明，红景天苷乳剂凝胶对大鼠深Ⅱ度烫伤创面具有修复作用。

烫伤创面愈合率=(原始烫伤面积- 各时间点未愈合面积)/原始烫伤面积×100%

(2)

2.4.4HE染色观察 实验结束后处死动物，取每组大鼠第3、6、11、15、21天时的局部烫伤皮肤HE染色(苏木素染细胞核，伊红染细胞质)，观察不同时间点的表皮再生、真皮中炎症细胞、成纤维细胞、胶原纤维的生长情况，具体结果见图7。

表5 烫伤后不同时间各组烫伤面愈合率的比较 %

注：与模型组相比，☆P<0.05；与红景天苷乳剂凝胶组相比，▽P<0.05，其余P>0.05。

由图7可知，各组3 d时，可见表皮层及毛囊、皮脂腺被严重破坏，组织排列紊乱，有炎性细胞浸润；6 d时，模型组表皮层结构坏死，无胶原细胞生成，真皮层有大量炎细胞浸润；11 d时，与模型组相比，给药组组织排列趋于均匀，炎性细胞浸润减少，成纤维细胞数量增加，有少量毛囊及皮脂腺出现，其中红景天苷乳剂凝胶组更明显；15 d时，模型组表皮层结构形成，真皮层大量炎症细胞浸润，可见少量成纤维细胞；阳性对照组与乳剂凝胶组新生表皮层组织结构分明，胶原纤维密集，毛囊密集清晰可见，间质中有少量炎性细胞浸润。21 d时，模型组可见表皮结构，仅有少量炎症细胞；阳性对照组与乳剂凝胶组可见完整的表皮层，真皮层可见新鲜毛囊组织。

2.4.5表皮性长因子(EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)阳性细胞检测 实验结束后处死动物，取每组大鼠第3、6、11、15、21 d时的局部烫伤皮肤，免疫组化染色后，检测烫伤肉芽组织中EGF、bFGF阳性细胞，利用image-pro plus 6.0图像分析系统观察分析结果，结果用平均光密度表示。由实验结果可知，各组实验大鼠在烫伤愈合的过程中，第6、11、15、21天红景天苷乳剂凝胶组与阳性对照组肉芽组织中bFGF和EGF表达量都明显高于模型组，且两者与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。具体结果见表6～7。

表6 不同时期肉芽组织中bFGF的表达

注：与模型组比较，*P<0.05；与红景天苷乳剂凝胶组比较，△P<0.05。下同。

表7 各组大鼠烫伤面愈合过程中不同时期肉芽组织中 EGF的表达

3 讨论

临床上外用制剂常用的有膏剂、洗剂、搽剂等，但这些传统剂型易造成涂布不均、污染衣物，有的还具有易挥发的缺点，因此临床应用具有一定的局限性。而外用凝胶是药物与辅料制成的均一、混悬的稠厚液体或半固体制剂。其局部给药后，患处表面皮肤吸收良好，可以避免口服给药存在的肝脏首过效应和胃肠道的破坏，降低药物的不良反应，除此之外，凝胶剂还有使用舒适、生物利用度高、易清洁等优点。本研究选取的凝胶基质为卡波姆，其具有释药快、易涂展、对皮肤无刺激性和过敏性等优点，非常适合作为创伤的外用制剂。因此，本研究将乳剂和凝胶相结合，制备了乳剂型凝胶，结果显示乳剂型凝胶适用于烫伤创面的治疗。

本研究优化红景天苷乳剂凝胶处方时采用的是Box-Behnken响应面法，目前国内筛选处方多采用单因素考察、正交设计或均匀设计法寻求最佳的因素水平组合，但不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式，从而无法找到整个区域上因素间的最佳组合和响应最优值。而本研究采用的Box-Behnken响应面法是通过表2～3的设计得到一定的实验数据，然后采用多元二次方程来拟合因素和效应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数(见表4)，是解决多变量问题的一种高效的统计方法。验证实验结果也显示，本研究理论优化结果与试验值差异较小，采用的非线性拟合模型接近客观事实，同时通过图1～6的响应面三维图也将各因素对指标的影响作用更为直观、方便地表现出来。

关于治疗效果，根据表5的实验结果可以看出，给药后21 d，给药组创面均已基本愈合，伤口愈合率自给药后均明显高于模型组(P<0.05)，且在相同时段内，乳剂凝胶组较阳性对照组愈合率明显更高(P<0.05)。说明红景天苷乳剂凝胶可加快烫伤创面的愈合速度，减小创面面积，与阳性药相比，肉眼观察效果大致相当。从图7 HE染色切片的结果中可以看出，前3 d各组组织结构不清晰，且炎性细胞浸润明显。自第6天起，给药组镜下可见新生表皮和新生纤维分化良好，排列整齐，愈合趋势明显。

烫伤有凝血期、炎症期、组织生成期、组织塑形阶段等过程，在这些过程中发挥作用的有中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞、角质细胞等[9]。凝血期最先发生，主要是止血的过程。炎症期持续时间较长，一般为3～5 d，分为炎症早期与炎症后期，炎症早期主要是清除微生物，后期主要是形成焦痂，清除炎症细胞，同时在缺氧环境下产生大量生长因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、EGF、bFGF、转化生长因子(TGF)等[10-11]。表6～7的结果表明，红景天苷乳剂凝胶组从第6天开始到第21天，EGF与bFGF的表达都显著增加，说明了红景天苷乳剂凝胶在一定程度上加快了发生创面的愈合速度，其原因可能是促进了EGF与bFGF的表达。

综上所述，本研究采用Box-Behnken响应面法优选的红景天苷乳剂凝胶的处方工艺，操作简单、质量稳定、重现性好。且其对大鼠Ⅱ度烫伤模型有良好的治疗作用，其作用机制可能是提高创面EGF和bFGF的表达而实现的。因此，本研究对扩展红景天苷治疗领域及新给药形式的进一步开发与利用提供了新思路。