基于“扶正祛邪”理论的生血宝合剂辅助治疗新型冠状病毒肺炎的可行性分析△

于金高，唐志书*，刘妍如，许洪波，周瑞，宋忠兴，闫亚峰，常爱冰，周建平

1.陕西中医药大学 陕西中药资源产业化省部共建协同创新中心/秦药特色资源研究与 开发国家重点实验室(培育)/陕西省创新药物研究中心，陕西 咸阳 712083；2.清华德人西安幸福制药有限公司，陕西 西安 710043

生血宝合剂是由制何首乌、女贞子、桑椹、墨旱莲、白芍、黄芪、狗脊经煎煮提取、减压浓缩制得的液体口服制剂，收载于2015版《中华人民共和国药典》，具有滋补肝肾、益气生血的功效，临床上用于治疗神疲乏力、头晕耳鸣等气血亏虚证以及用于放疗、化疗、缺铁性贫血等的辅助治疗。临床研究表明，生血宝合剂等补血剂具有提升机体造血机能、提高血液中各类型T细胞和自然杀伤细胞水平、改善机体炎症状态、缓解疲劳感等作用[1-3]。

2019年底湖北省武汉市及其周边城市爆发的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由新型冠状病毒(2019-nCoV或SARS-CoV-2)感染引起的呼吸系统疾病[4-5]，主要表现为肺部毛玻璃样病变，伴随发热、咳嗽、呼吸困难、疲倦以及部分胃肠道系统症状，重症患者还伴随脓毒症休克、代谢性酸中毒和凝血功能障碍[6]。总之，免疫功能紊乱、肺部炎性损伤以及凝血功能异常等是COVID-19的主要病理特征，其中炎症风暴的产生是患者病情恶化的重要原因之一[7]。

目前，中医药在防治COVID-19过程中发挥了一定作用，能够多途径协同发挥调节机体免疫力、抑制炎性反应等作用，从而明显改善患者各方面症状，缩短病程，减少危重症患者的发生率，降低病死率[8]。在COVID-19疾病恢复期，人参、黄芪等补虚药被广泛用于患者康复调理，起到了良好的辅助治疗作用，这些都体现了中医药“扶正祛邪”治疗理念的优势。由于生血宝合剂是临床上常用的补血剂，主要作用于血液循环系统，且能显著提升机体免疫功能，故本课题组基于网络药理学和分子对接技术，探讨生血宝合剂对COVID-19的潜在辅助治疗作用，为生血宝合剂的临床应用提供合理依据。

1 资料与方法

1.1 生血宝合剂化学成分收集

中药系统药理学分析平台[9](TCMSP，http：//tcmspw.com/)对常用的499种中药当中的12 144个化学成分进行了系统收集整理，本研究借助该平台搜索“何首乌”“女贞子”“桑椹”“墨旱莲”“白芍”“黄芪”“狗脊”等关键词，并结合PubChem数据库(http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)收集生血宝合剂中的化学成分以及各化学成分的药代动力学等参数。

1.2 化学成分及其靶标蛋白筛选

根据收集到的化学成分列表及其附带的口服生物利用度(OB)、类药性(DL)等信息，以OB≥30%或DL≥0.18作为筛选阈值，筛选生血宝合剂中能被较好地吸收入血的化学成分，作为潜在活性成分。在此基础上，进一步借助TCMSP数据库查询潜在活性成分的靶标蛋白，并借助UniProt数据库(https：//www.uniprot.org/)、GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)等将靶标蛋白名称转换为对应的基因名称。

1.3 抗病毒性肺炎活性成分-靶点网络的构建

将筛选出的潜在活性成分及其对应的靶标蛋白基因列表等信息输入Cytoscape 3.7.2软件(http：//www.cytoscape.org/)[10]，构建潜在活性成分的靶点网络，并将化合物对应靶点与MalaCards数据库(https：//www.malacards.org/)中重症急性呼吸综合征(SARS)等疾病的病理靶点进行叠加，取交集，筛选出与呼吸道病毒关联密切的靶点，其对应的活性成分作为生血宝合剂的抗病毒性肺炎活性成分。

1.4 靶点通路分析

为进一步获得各靶点的生物学功能以及涉及的生物学通路信息，将靶标蛋白基因列表导入UniProt数据库将靶基因名称规范化校正，并导入R软件(V3.6)Bioconductor平台中的Cluster profiler进行基因本体(GO，gene ontology)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路分析。同时借助STRING 11.0数据库(https：//string-db.org/)查询靶点间相互作用信息。

1.5 抗病毒性肺炎活性成分-靶点分子对接

为进一步筛选生血宝合剂中可能干预2019-nCoV感染过程的潜在活性成分，将1.3中交集分析筛选出的抗病毒性肺炎活性成分与人血管紧张素转换酶2(ACE2)以及2019-nCoV病毒的S蛋白[11]进行分子对接：以ChemOffice软件构建活性成分3D分子结构，并调整空间构象，使其能量最小化，保存为*mol2格式。从PDB数据库(https：//www.rcsb.org/)下载靶蛋白的三维晶体结构(PDB编号为2ajf和6vsb，*PDB格式)，采用LibDock分子对接程序进行分子对接，用程序内置的LibDockSocre打分函数筛选分值>100的复合物构象。筛选出的构象对应的活性成分即为可能具有抗COVID-19作用的活性成分。

2 结果

2.1 化学成分的收集

以OB和DL为主要筛选条件，结合生血宝合剂中各中药的化学成分研究进展，共获得143个化学成分。其中来源于何首乌的成分主要为大黄素、大黄酚等蒽醌类以及白藜芦醇、没食子酸、儿茶素等多酚类成分；来源于女贞子的成分主要为木犀草素、芹菜素、槲皮素等黄酮类以及女贞苷、红景天苷、羟基酪醇等；来源于桑椹的成分主要为花青素、杨梅素、桑色素、芦丁等黄酮类成分；来源于墨旱莲中的成分主要为木犀草苷、芹菜素、金合欢素、红车轴草素等黄酮类成分；来源于白芍中的成分主要为芍药苷等单萜糖苷类以及儿茶素、没食子酸、山柰酚等酚酸或黄酮类成分；来源于黄芪的成分主要为毛蕊异黄酮、芒柄花素等黄酮类以及少量三萜类成分(主要成分黄芪甲苷等三萜皂苷类因OB和DL值均低于设定的阈值，故未纳入研究)；来源于狗脊的成分主要为牛膝甾酮等。经过文献分析[12-17]，本研究收集的化合物均为生血宝合剂各药味的主要活性成分，且这些成分均能通过口服吸收入血，因此能够较好地代表生血宝合剂的药效物质基础。

2.2 抗病毒性肺炎活性成分筛选

生血宝合剂中筛选出的主要化学成分经TCMSP数据库查询，共得660个体内相互作用靶点(见图1)；将这些靶点与SARS相关病理靶点进行交集分析后，进一步得到39个共有靶点(见图1、表1)，并对应着45个活性成分(见表2)。这表明生血宝合剂可能通过调节这39个呼吸道病毒相关靶点发挥抗病毒性肺炎作用，且这45个化学成分是关键的抗病毒性肺炎活性成分。

注：蓝色圈代表潜在活性化学成分匹配的靶点；黄色圈代表SARS相关病理靶点；两者交集为共有靶点。图1 生血宝合剂化学成分作用靶点与 SARS相关病理靶点的交集分析图

对共有靶点的分析表明，生血宝合剂主要通过调节机体炎症反应、固有免疫系统功能、氧化-抗氧化平衡、病毒入侵、组织器官损伤等生理/病理过程发挥抗病毒性肺炎作用。另外，机体凝血功能参与了固有免疫系统的启动过程，在抵抗炎症的过程中起重要作用。在39个共有靶点中，有23个靶点与机体免疫和炎症过程相关，可见调节机体免疫和炎症是生血宝合剂最主要的作用途径。在病毒入侵过程相关靶点中，肾素-血管紧张素通路占主要部分，包括肾上腺素能受体、肾素、血管紧张素转换酶等，该通路恰是SARS病毒和2019-nCoV病毒入侵机体的主要途径[11，18]。

表1 生血宝合剂的抗病毒性肺炎作用靶点(共有靶点)

注：表中靶点缩写和对应的功能来自于UniProt或GeneCards数据库。

表2 生血宝合剂抗病毒性肺炎活性成分

注：抗病毒性肺炎活性成分即共有靶点对应的活性成分，TCMSP_ID为TCMSP数据库中化合物分子识别号。

对45个抗病毒性肺炎活性成分的分析表明，黄酮类成分(23个)是生血宝合剂的主要的活性成分，占总数的51%，主要来自于女贞子、桑椹、墨旱莲、白芍、黄芪等药味；其次是蒽醌类(4个)、多酚和酚酸类(6个)成分，共占总数的22%，主要来自于何首乌、白芍等药味；其余成分如萜类、甾酮等主要来自于墨旱莲、女贞子、白芍、狗脊等药味。综合以上结果，何首乌、白芍、墨旱莲、女贞子、桑椹等药味相对贡献较大，大致与生血宝合剂的组方规律相吻合，即何首乌补肝肾、益精血为君药，女贞子、墨旱莲、桑椹等滋补肝肾为臣药，白芍等养血柔肝为佐使药。

2.3 中药-活性成分-靶点网络和生物学通路分析

为进一步明确生血宝合剂各药味、抗病毒性肺炎活性成分、作用靶点三者之间的相互关系，采用Cytoscape软件对三者进行网络分析(见图2)，采用度值(Degree)衡量各节点的权重。在7味中药中，桑椹、女贞子、墨旱莲的度值最高，依次为86、80、58，狗脊度值最低；主要原因为桑椹、女贞子、墨旱莲贡献了较多的黄酮类成分，该类成分是主要的抗病毒性肺炎活性成分，而狗脊仅贡献了1个成分。在39个靶点中，前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)、转录因子AP1(JUN)、(白介素-6)IL6、白介素-10(IL10)、肾上腺素能受体(ADRB2)等度值最高，依次为91、45、44、38、38，其原因为PTGS1与各活性成分的连接最多，而JUN、IL6、IL10、ADRB2等靶点与其他靶点相互作用紧密。

GO富集分析和KEGG富集分析表明，生血宝合剂主要干预病原体应答(response to lipopolysaccharide、response to molecule of bacterial origin)、细胞因子生成(positive regulation of cytokine production)、抗体应答(response to antibiotic)、免疫细胞激活(regulation of leukocyte cell-cell adhesion、regulation of T cell activation)等生物学过程，主要涉及炎症应答相关通路(Inflammatory bowel disease、IL-17 signaling pathway、cytokine-cytokine receptor interaction)和病毒感染相关通路(Influenza A、Viral protein interaction with cytokine and cytokine receptor)等(见图3)。

综合以上结果并结合表1，可见炎症调节、病毒入侵等环节是生血宝合剂最主要的抗病毒性肺炎作用途径。

注：■中药；●化学成分；◆靶点；中药与化学成分之间以实线连接；化学成分与靶点之间以虚线连接；靶点之间以实线连接，并根据靶点之间的相互作用强度设置连线粗细。图2 生血宝合剂中药-活性成分-抗病毒性肺炎作用靶点网络

注：A.共有靶点涉及的生物学过程，来源于GO富集分析；B.共有靶点涉及的生物学通路，来源于KEGG通路富集分析。图3 生血宝合剂抗病毒性肺炎可能涉及的生物学过程和生物学通路

2.4 分子对接

ACE2蛋白是宿主细胞膜表面蛋白，其正常功能是催化生成血管紧张素，SARS病毒和2019-nCoV病毒均通过结合至该靶点从而通过胞吞作用进入细胞，而2019-nCoV病毒蛋白衣壳上的刺突糖蛋白(即S蛋白)在此过程中起着关键作用，该蛋白的活性结构域能与人ACE2蛋白紧密结合，从而诱导产生胞吞作用[11]。采用LibDock对接程序将生血宝合剂中的抗病毒性肺炎活性成分依次与这些蛋白进行对接，并经打分程序评分，得到女贞果苷D、西托糖苷、长春藤皂苷元、紫铆素、芦丁等得分>100的活性成分，这些成分可能对病毒入侵过程起到直接的干预作用(见表3)。另外，从表3的数据可知，同一个化学成分与人ACE2和2019-nCoV的S蛋白对接时，其分值均较接近，原因可能是2个靶蛋白的活性域结构具有互补性，小分子结合到任一蛋白活性域均能干扰两者的结合。

图4展示了女贞果苷D与ACE2和2019-nCoV S蛋白的对接情况，其中女贞果苷D与ACE2蛋白TRP436等位点间存在氢键等相互作用，与2019-nCoV S蛋白ARG393等位点存在氢键和Pi-阳离子等相互作用。

表3 生血宝合剂活性成分与ACE2和 2019-nCoV S蛋白对接结果

注：—表示得分<100。

注：A.ACE2蛋白靶点对接图；B.2019-nCoV S蛋白对接图；各图左侧为对接构象，右侧为分子间作用力位点；不同分子间作用力以不同颜色表示，女贞果苷D为蓝色骨架。图4 女贞果苷D与关键靶蛋白活性域的对接构象和分子间作用力分布

3 讨论

相对于化学药和生物药，中医药在应对SARS、COVID-19等疫情方面有着特殊的优势。一方面，由于疫情爆发迅速、病毒致病特点未知、化学药物作用靶点单一等原因，在疫情防治过程中很容易陷入无药可用和盲目治疗的尴尬境地；中医药因诊断和治疗方法不基于未知病毒，而是基于人体感染病毒后出现的不同临床症状，辨别证型，对证下药，因而能够做到迅速开具个体化处方，减少病情贻误，且经济简便，易于被患者接受。另一方面，在治疗理念上，中医药注重“扶正祛邪”，通过提高机体的免疫能力，加快机体自愈。从中医药防治COVID-19的整体效果来看，降低炎症水平、防止发生炎症风暴，是中医药的核心作用之一，体现了中医药“调节机体而非单纯治病”这种治疗理念的优势。

本研究借助网络药理学和分子对接技术，试图揭示生血宝合剂可能的抗病毒性肺炎作用及其蛋白靶点以及对应的活性成分。研究表明，调节机体免疫功能、改善炎症反应是生血宝合剂主要的作用途径，对应的活性成分为黄酮、多酚、蒽醌等类成分。任越等[29]通过构建花生四烯酸代谢通路相关药效团模型，从中药化学成分数据库中筛选出了大黄素甲醚葡萄糖苷等具有潜在抑制炎症风暴的小分子。而本研究同样表明，大黄素类成分能够与炎症相关靶点产生相互作用。

另外，调节机体凝血功能也是生血宝合剂的可能作用途径，表明生血宝合剂可能通过对血液循环系统的调节发挥治疗COVID-19的作用。最后，针对2019-nCoV 入侵机体的刺突蛋白和ACE2蛋白，采用分子对接方法寻找生血宝合剂中可能直接抑制该病毒的活性成分，结果显示来自于女贞子的女贞果苷D、西托糖苷、长春藤皂苷元、紫铆素、芦丁等具有较高的对接得分，可能具有潜在的开发价值。

目前，中医药预防和治疗方案中，玉屏风散等益气固表方主要用于预防阶段；麻杏石甘汤等清热剂应用最广，主要用于治疗阶段；而在恢复阶段主要采用具有益气养阴功效的补益剂[6]。本研究的结果提示，生血宝合剂可能通过增强机体免疫功能、调节炎症、调节血液循环系统功能等，从而可能对COVID-19起到辅助治疗作用；且生血宝合剂作为临床上常用的补血剂，较适合于恢复期调养的患者或治疗期伴随贫血症状的患者。