不同栽培方式 产地蒙古黄芪中黄芪甲苷和总黄酮含量差异分析△

田文仓，冯紫薇，石福娟，石玥，张靖晗，丁一明， 栾震，宋学武，赵婷，4*，魏胜利，4*

1.北京中医药大学 中药学院，北京 102488；2.子洲县产业发展投资有限公司，陕西 榆林 718400；3.中华人民共和国国家卫生健康委员会 药具管理中心，北京 102488；4.中药材规范化生产教育部工程研究中心，北京 100102

黄芪为临床常用的大宗药材，来源于豆科植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao或膜荚黄芪A.membranaceus(Fisch.) Bge.的干燥根[1]。笔者前期调研发现目前市场流通的黄芪商品主要为蒙古黄芪，而膜荚黄芪较少，由此可见蒙古黄芪是药用黄芪的主要来源。蒙古黄芪分布范围极广，根据詹志来等[2]及笔者实地调研发现蒙古黄芪现在主要分布于甘肃、内蒙、山西、陕西、宁夏等地。这些产地之间地理位置跨度大，环境迥异且各地长期以来形成了本地特有的黄芪栽培方式及产地加工技术，因此所产黄芪药材质量参差不齐[3-5]。皂苷类(黄芪甲苷)和黄酮类成分是黄芪药效成分的主要组成部分。研究表明黄芪甲苷具有抗炎、抑制肿瘤、保护肝损伤等作用[6-7]，黄芪中黄酮类成分具有抗氧化、抗病毒、抑制黑色素生成等作用[8]。因此研究以采自33个蒙古黄芪主产地的蒙古黄芪药材为研究材料，以黄芪甲苷和总黄酮为评价指标，对不同栽培方式和不同产地蒙古黄芪进行差异分析，进而分析差异形成原因，以期为栽培、选购优质黄芪药材提供理论依据。

1 材料

Waters ACQUITY-UPLC-TUV-ELS型高效液相色谱仪；AL204型电子分析天平(d=0.000 1 g，梅特勒-托利多仪器有限公司)；RE-3000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；UV-1700PC紫外-可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)。

黄芪甲苷(上海融禾医药科技有限公司，批号141209，纯度：99.45%)；毛蕊异黄酮葡萄糖苷(上海融禾医药科技有限公司，批号：160120，纯度：99.2%)；乙腈[色谱纯,CAS:75-05-8，赛默飞世尔科技(中国)有限公司]；甲醇(分析纯，批号：20181125，北京化工厂)；乙醇(分析纯，批号：20181211，北京化工厂)；实验室用水为超纯水。

所用的样品为课题组在2018年9—11月采集的33批蒙古黄芪药材，经北京中医药大学中药学院魏胜利教授鉴定为蒙古黄芪A.membranaceus(Fisch.) Bge. var.mongholicus(Bge.) Hsiao的根，凭证标本存放于北京中医药大学中药资源样品库，样品信息见表1。

2 方法

2.1 对照品溶液制备

黄芪甲苷对照品溶液的配制：精密称取黄芪甲苷(105 ℃烘至恒重)对照品适量，70%甲醇定容制成质量浓度为0.75 mg·mL-1的对照品储备溶液，备用。

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液的配制：精密称定毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(105 ℃烘至恒重)2.96 mg，用75%乙醇溶解并定容至50 mL，摇匀，即得0.059 2 mg·mL-1的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

表1 试验样品信息

2.2 供试品溶液制备

黄芪甲苷含量测定的供试品溶液制备：精密称取药材粉末2.0 g，置50 mL离心管中，加甲醇30 mL，超声(功率500 W，频率40 kHz)处理30 min，2000 r·min-1离心(离心半径为3 cm)5 min，取上清液。残渣再加甲醇30 mL，超声(功率500 W，频率40 kHz)处理30 min，2000 r·min-1离心(离心半径为3 cm)5 min，取上清液。合并上清液，蒸干。残渣加10%(V/V)氨水溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容，即得。

总黄酮含量测定的供试品溶液制备：精密称取黄芪药材粉末0.5 g，加25 mL 75%乙醇，超声(功率500 W，频率40 kHz)处理30 min，滤过，适量75%乙醇洗涤滤渣，合并滤液并定容至50 mL，从中精密量取2.0 mL溶液转移至10 mL容量瓶中，再用75%乙醇定容，即得。

2.3 色谱条件

Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：水-乙腈(68∶3)；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；氮气流速：2 L·min-1；进样量：20 μL。在上述色谱条件下，黄芪甲苷对照品、样品色谱图见图1。

注：A.黄芪甲苷对照品；B.供试品。图1 黄芪甲苷对照品及供试品色谱图

2.4 总黄酮测定光谱条件

以毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为对照品，在260 nm下测定对照品及样品吸光度值。对照品及样品光谱图见图2。

注：A.对照品；B.供试品。图2 对照品及供试品光谱图

2.5 方法学考察

2.5.1线性关系考察 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液1、5、10、15、20、25 μL分别进样，记录峰面积。以黄芪甲苷的进样浓度的对数为横坐标X，峰面积积分值的自然对数值为纵坐标Y，绘制标准曲线，其回归方程为Y=1.481 2X+16.045，r=0.999 4。结果表明黄芪甲苷的进样量在0.75～18.755 μg线性关系良好。

精密量取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液1、2、4、6、8 mL置25 mL容量瓶中，75%乙醇定容。以75%乙醇作为空白，分别取适量不同浓度对照品溶液，在260 nm波长处测定吸光度。以对照品溶液浓度X为横坐标，吸光度Y为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为Y= 56.794X+0.001 9，r=0.999 9。结果表明总黄酮进样量在0.059 2～0.473 6 mg线性关系良好。

2.5.2精密度试验 精密吸取黄芪甲苷对照品溶液20 μL，连续进样6次，测得峰面积，求得RSD为1.37%，表明仪器精密度良好。

取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液适量，连续测定6次，测得吸光度。求得RSD为0.09%，表明仪器精密度良好。

2.5.3重复性试验 平行精密称取同一样品6份，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，结果黄芪甲苷平均质量分数为1.04 mg·g-1，RSD为2.0%，说明该方法重复性良好。

平行精密称取同一样品6份，分别按2.2项下方法制备供试品溶液，测吸光度，计算总黄酮含量，结果总黄酮质量分数平均值为4.79 mg·g-1，RSD为0.05%，表明该方法重复性良好。

2.5.4稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于配制后0、2、4、8、12、24 h进样，测得黄芪甲苷含量RSD为1.0%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

取同一供试品溶液，分别于配置后0、2、5、8、20 h测定吸光度值，测得黄酮含量RSD为1.59%，表明供试品溶液在20 h内基本稳定。

2.5.5回收率试验 精密称取已知黄芪甲苷质量分数(1.04 mg·g-1)的同一批样品约2 g，共6份，精密加入黄芪甲苷对照品(0.192 mg·mL-1)各5 mL，按2.2项下方法制备供试溶液并测定，计算回收率，结果见表2。

表2 黄芪甲苷测定的加样回收率(n=6)

精密称取已知总黄酮质量分数(4.296 mg·g-1)的同一批样品约0.5 g，共6份，分别置50 mL具塞锥形瓶中，再分别精密加入毛蕊异黄酮苷对照品溶液(0.059 2 mg·mL-1)25 mL，按2.2项下方法制备供试溶液，测定吸光度，计算回收率，结果见表3。

表3 总黄酮测定的加样回收率(n=6)

2.5.6样品测定 33批样品分别平行取3份，按上述2种方法分别进行测定，计算含量。

2.6 数据处理

所有数据均采用Microsoft Excel software 2010及SPSS 19.0进行分析。采用单因素方差分析(ANOVA)对Duncan′s进行多因素检验，其中P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 不同产地、栽培方式蒙古黄芪黄芪甲苷及总黄酮含量测定结果

不同产地、栽培方式蒙古黄芪黄芪甲苷、总黄酮含量的测定结果见表4。

表4 不同产地、栽培方式蒙古黄芪中黄芪甲苷和 总黄酮质量分数 %

3.2 不同栽培方式蒙古黄芪中黄芪甲苷及总黄酮含量差异分析

蒙古黄芪有育苗移栽和种子直播2种栽培方式。全国大多数产区普遍采用育苗移栽的栽培方式，一般育苗1年后，再移栽生长1年即可采收，所产黄芪是市场主流产品。种子直播方式只在山西浑源、陕西子洲及其周边地区采用，直播黄芪一般生长5年或5年以上才可采收。对2种栽培方式下的蒙古黄芪中黄芪甲苷和总黄酮含量分别进行分析，结果表明2种栽培方式下的黄芪甲苷含量差异有统计学意义(P<0.05)。种子直播蒙古黄芪中黄芪甲苷平均质量分数为0.245%，为育苗移栽蒙古黄芪中黄芪甲苷平均质量分数(0.151%)的1.6倍。而2种栽培方式下的总黄酮含量无统计学意义(P>0.05)，种子直播蒙古黄芪药材总黄酮平均质量分数为0.541%，育苗移栽蒙古黄芪总黄酮平均质量分数为0.508%。

3.3 不同产地蒙古黄芪中黄芪甲苷及总黄酮含量差异分析

3.3.1不同产地育苗移栽蒙古黄芪中黄芪甲苷及总黄酮含量差异分析 通过对不同产地育苗移栽蒙古黄芪中黄芪甲苷和总黄酮含量测定及分析，结果表明，各产地育苗移栽蒙古黄芪中黄芪甲苷含量和总黄酮含量差异均有统计学意义(P<0.05)。其中黄芪甲苷质量分数最高达到0.323%，为最低值(0.061%)的5倍。总黄酮质量分数最高达到0.903%，为最低值(0.376%)的2.4倍。

3.3.2不同产地种子直播蒙古黄芪中黄芪甲苷及总黄酮含量差异分析 通过对不同产地种子直播蒙古黄芪药材的黄芪甲苷和总黄酮含量测定及分析发现，各产地蒙古黄芪中黄芪甲苷和总黄酮含量差异有统计学意义(P<0.05)。其中黄芪甲苷含量最高的药材来源于陕西省子洲县西庄乡(0.343%)，是质量分数最低的陕西省佳县(0.161%)的2.13倍。总黄酮质量分数最高的样品来源于陕西省府谷县，高达0.825%，为质量分数最低的陕西省子洲县三川口(0.399%)的2.07倍。

4 结论与讨论

4.1 不同栽培方式蒙古黄芪中黄芪甲苷含量差异有统计学意义，总黄酮含量差异无统计学意义

结果表明采用种子直播所生产的蒙古黄芪中黄芪甲苷含量相对高于育苗移栽所产蒙古黄芪的，且差异有统计学意义。由样品信息可知，种子直播黄芪生长年限一般为5年，有些甚至5年以上，而育苗移栽黄芪生长年限为2年，因此上述差异可能是由于生长年限长导致，而非仅仅是种植方式的不同导致。研究表明黄芪甲苷会随着生长年限有先升后降的变化趋势，降低的转折点在5年或6年[9]，因此5年生黄芪药材黄芪甲苷含量一般是高于2年生黄芪药材。2种栽培方式下总黄酮含量差异无统计学意义，这与刘凤波[10]的研究结果一致。

本研究考察的是不同栽培方式对黄芪药材黄芪甲苷和总黄酮含量的影响，但由于受时间及空间的限制，未能保证除栽培方式以外其他因素完全一致，这也是目前这类研究[11-12]存在的普遍问题，因此对于考察栽培方式的影响还有待更加科学的试验设计来完成。

4.2 不同产地蒙古黄芪中黄芪甲苷和总黄酮含量差异明显

产地是道地药材形成的原因之一，而产地对药材的影响是与其所在地的环境因子是紧密相关的。结果表明，不论是育苗移栽种植还是种子直播种植，不同产地蒙古黄芪中黄芪甲苷和总黄酮含量差异均有统计学意义。因此在种植或选购优质黄芪药材时要充分考虑产地因素，从结果看，选择黄芪甲苷含量较高的黄芪应该选择山西浑源或陕西子洲产的种子直播黄芪，选择总黄酮含量较高的黄芪则选择宁夏固原的育苗移栽黄芪更经济实惠。