牛樟芝固态发酵菌丝体三萜及多糖提取工艺优化研究

邓春萌, 王哑倩, 吴美媛

1.江苏大学环境与安全工程学院, 江苏 镇江 212013;2.丽水学院, 浙江 丽水 323800

牛樟芝是一种寄生于台湾特有树种(牛樟树)上的珍稀药食两用腐木真菌。据现代药理研究证实，牛樟芝含有三萜、多糖、超氧化物歧化酶、腺苷、蛋白质、维生素和木质素等多种生物活性物质，其中以三萜类和多糖类物质为主[1-3]，这两类活性物质具有抗肿瘤、保护肝脏、抗炎、抗氧化等功效[4-10]，但因其寄主专一性强且生长缓慢、数量稀少，所以十分珍贵[11-12]。牛樟芝菌丝体固态发酵是一种人工培养方式，可模拟牛樟芝生长环境,打破牛樟树稀少的局限性，其发酵产物主要成分及代谢产物与牛樟芝子实体接近[13-16]，这为牛樟芝提取物的产业化生产提供了可能。

正交试验法以概率论、数理统计及实践经验为基础，以标准化正交表设计方案，能够实现快速优化方案的目的，是一种目前较为常用的工艺优化分析方法[17-19]。本文采用正交试验法分别对牛樟芝固态发酵菌丝体中主要的生物活性物质三萜和多糖的提取工艺进行优化，以期为牛樟芝固态发酵菌丝体生物活性物质的产业化生产提供依据，同时为其活性研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料及设备

牛樟芝固态发酵菌丝体(浙江方格药业有限公司)；BSA124S-CW型电子天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]；H2050R型台式离心机(湖南湘仪公司)； DF-101SA-H型集热式恒温加热磁力搅拌器(南京科尔仪器设备有限公司)；751紫外-可见分光光度计(上海分析仪器厂)。

1.2 三萜的提取工艺

称取5 g牛樟芝固态发酵菌丝体细粉置于烧杯中，加入一定比例90%乙醇，一定温度下搅拌提取一定时间，离心收集上清液，过滤，溶液定容于250 mL容量瓶定容，备用。

1.3 三萜提取正交试验

按照1.2所述提取方法，采用L9(34)正交试验方法，设置浸提时间、料液比和提取温度3个因素，每个因素3个水平，以三萜得率作为考察指标，其因素与水平见表1，每组设置3次平行试验。

表1 三萜提取的因素与水平Table 1 Factors and levels of triterpene extraction

1.4 三萜含量的测定

标准曲线的制作：称取熊果酸10.00 mg，加入乙醇定容至100 mL，得到浓度为0.10 mg·mL-1的熊果酸标准溶液。量取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL熊果酸对照样液，分别加乙醇至2 mL，水浴挥干，加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和1 mL高氯酸，70 ℃水浴35 min，冰浴10 min，加入5.00 mL冰醋酸，摇匀后冷却至室温，并设置空白对照组。采用紫外-可见分光光度计于548 nm处测定吸光度值(A)，以熊果酸质量浓度为X轴，A值为Y轴绘制标准曲线[20]。

待测样液检测：将1.2中待测提取液稀释一定比例按上述方法测定，根据标准曲线计算提取液中三萜的浓度。

1.5 多糖的提取工艺

称取5 g牛樟芝固态发酵菌丝体细粉置于烧杯中，加入一定比例90%双蒸水，一定温度下搅拌提取一定时间，离心收集上清液，过滤，溶液于250 mL容量瓶定容，备用。

1.6 多糖提取的正交试验

按照1.5所述提取方法，采用L9(34)正交实验方法，设置浸提时间、料液比和提取温度3个因素，每个因素设置3个水平，以多糖得率作为考察指标，其因素与水平见表2，每组设置3次平行试验。

表2 多糖提取的因素水平Table 2 Factors and levels of polysaccharides extraction

1.7 多糖含量的测定

标准曲线的制作：称取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖10 mg，加入双蒸水溶解定容至100 mL，得到浓度为0.1 mg·mL-1的葡萄糖标准溶液。分别量取0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL葡萄糖标准溶液置于具塞试管中，分别加水至2 mL，各加入5%的苯酚溶液1 mL混合均匀，加入浓硫酸5 mL，震荡均匀，置于30 ℃水浴20 min，另以蒸馏水2 mL同上操作，为空白对照。于490 nm处测定吸光度(A)，以葡萄糖浓度为X轴，A值为Y轴绘制标准曲线[2]。

待测样品检测：将1.5中待测提取液稀释一定比例按上述方法测定，根据标准曲线计算提取液中多糖浓度。

1.8 提取得率的计算

三萜得率=三萜质量/牛樟芝固态发酵菌丝体细粉质量×100%

多糖得率=多糖质量/牛樟芝固态发酵菌丝体细粉质量×100%

2 结果与分析

2.1 牛樟芝固态发酵菌丝体中三萜提取的正交试验

采用正交试验法考察了浸提时间、料液比和提取温度对三萜提取含量的影响，试验结果如表3所示。由表3中R2值可知，3个因素的影响顺序为B>C>A，即料液比>提取温度>浸提时间。由K值分析最佳提取条件为(A3B3C2)，由试验得率分析最佳提取条件为(A1B3C3)，两个最佳提取条件不一致。

2.2 牛樟芝固态发酵菌丝体中三萜提取的验证试验

对K值分析最佳提取条件(A3B3C2)与得率试验最佳条件(A1B3C3)各进行5次验证试验。结果表明，A3B3C2条件下提取的三萜得率为3.43%，A1B3C3条件下得率为3.30%，因此牛樟芝固态发酵菌丝体三萜的最佳提取条件为A3B3C2，即浸提时间3 h、料液比1∶30 (g·mL-1)、温度70 ℃,该条件下三萜得率为3.43%。

表3 三萜提取的正交试验结果Table 3 Orthogonal test results of triterpene extraction

2.3 牛樟芝固态发酵菌丝体中多糖提取的正交试验

采用正交试验法考察了浸提时间、料液比和提取温度对多糖提取含量的影响，试验结果如表4所示。由表4中R2值可知，3个因素的影响顺序为B>C>A，即料液比>提取温度>浸提时间。由K值分析最佳提取条件为(A2B3C3)，由试验得率分析最佳提取条件为(A2B2C3)，两个最佳提取条件不一致。

2.4 牛樟芝固态发酵菌丝体中多糖提取的验证试验

对K值分析最佳提取条件(A2B3C3)和试验得率分析最佳提取条件(A2B2C3)各进行5次验证试验。结果表明，A2B2C3条件下提取的多糖得率为4.71%，A2B3C3条件下多糖得率为4.34%，因此牛樟芝固态发酵菌丝体多糖的最佳提取条件为A2B2C3，即浸提时间2 h、料液比1∶20(g·mL-1)、温度95 ℃,该条件下多糖得率为4.71%。

表4 多糖提取的正交试验结果Table 4 Orthogonal test results of polysaccharides >extraction

3 讨论

牛樟芝因含有三萜、多糖及超氧化物歧化酶等多种活性成分且在抗肿瘤、护肝及抗炎等方面具有良好功效而备受关注。黄红雨等[20]采用响应面试验法对牛樟芝三萜提取工艺进行优化，最佳提取条件为：乙醇浓度 78%、提取时间 81 min、料液比1∶20 (g·mL-1)，得率为5.26%。吕莎等[6]采用效应面法优化牛樟芝三萜的提取条件，最佳提取条件为：加20倍量的90%乙醇，超声提取2次，每次40 min，超声功率 400 W，得率为11.87%。王宫等[21]采用正交试验法优化牛樟芝多糖的提取工艺，最佳提取条件为：温度 100 ℃，料水比1∶20 (g·mL-1)，提取时间2 h，得率为0.59%左右。杨彬君等[10]采用水提醇沉法提取牛樟芝多糖，得率为3.02%。但由于牛樟芝较为稀少珍贵，大规模开发应用成为难题[13,20]。

本研究以牛樟芝固态发酵菌丝体粉末为提取材料，并采用正交试验法分别对其三萜和多糖的提取工艺进行优化，得到三萜的最佳提取工艺为：浸提时间3 h、料液比1∶30 (g·mL-1)、温度70 ℃，得率为3.43%，多糖的最佳提取工艺为：浸提时间2 h、料液比1∶20 (g·mL-1)、温度95 ℃，得率为4.71%。本研究采用传统提取方法，工艺简单便于生产；与前人关于牛樟芝三萜和多糖的研究结果相比，牛樟芝固态发酵菌丝体的三萜提取得率有所下降，多糖提取得率有所提升，分析可能与牛樟芝固态发酵培养方式所得为菌丝体和培养基混合物相关[13]。本研究可为牛樟芝固态发酵菌丝体生物活性物质的产业化生产和活性研究提供参考。