丰富环境对阿尔茨海默氏症模型小鼠行为和神经发生的影响*

何玉欣 张雨微 雷 新 王雨亭 李 倩 付 静

皖南医学院，安徽省芜湖市 241002

阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s Disease, AD)是一种起病隐匿的以进行性痴呆为症状的中枢神经系统退行性疾病。病理学上，AD由淀粉样β斑块(Aβ)、含有磷酸化tau蛋白(p-tau)的神经原纤维缠结和脑血管病组成[1]。患者由于突触的逐渐丧失以及神经元的死亡而发生学习和记忆障碍[2]。目前AD没有较好的治疗方法，尽管研究工作增进了对疾病的机制的了解，但对疾病治疗仍未有较大突破，这可能是因为一旦发生认知障碍，就会出现不可逆的神经元损伤，因此目前的研究集中在早期发现和早期干预[3]。丰富环境(Enriched Enrichment, EE)可以提供丰富多感官、多运动的刺激，且囊括训练学习的锻炼功能，被认为有益于哺乳动物认知功能改善，可能是治疗AD的有效方法。因此本研究拟采用连续腹腔注射D-半乳糖建立C57/B16小鼠的AD模型，并饲养在丰富环境下，探究其对AD小鼠行为和神经发生的影响，为AD进一步治疗和研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 将30只6个月龄C57/B16雄性小鼠，饲养于皖南医学院动物房，常温、常湿饲养，动物自由摄取食物和饮水。

1.2 主要实验仪器与试剂 Morris水迷宫及视频分析系统(北京众实迪创科技发展有限公司)；冰冻切片机(ThermoHM525NX)；激光共聚焦扫描显微镜。D-半乳糖(MACKLIN麦克林)；免疫荧光一抗：大鼠抗BrdU，羊抗DCX；二抗：驴抗大鼠594，驴抗羊488；4%多聚甲醛，蔗糖，胎牛血清BSA，PBS漂洗液，甘油封片剂。

1.3 实验分组 将30只6个月龄的C57/B16雄性小鼠随机分成三组，其中一组为正常对照组，饲养于标准环境中；另两组连续8周腹腔注射D-半乳糖(120mg/kg)建立AD模型。AD模型小鼠中的一组饲养于特制的丰富环境中(饲养笼较标准笼大，内置若干管道、滚轮、小球玩具等装置)为丰富环境组，另一组饲养在标准环境中设置为AD对照组。

1.4 旷场行为学检测(Open-Field test,OFT) 旷场仪器主要由一个60cm×60cm×45cm的空旷封闭箱子组成，内置摄像头。实验在昏暗光线下进行，选用30min记录小鼠旷场行为学。记录的参数包括水平运动次数、直立次数和理毛次数。

1.5 水迷宫行为学检测(Morris-Water Maze test,MWM) 水迷宫是一直径80cm的水池，配备轨迹跟踪和电脑分析系统。实验连续进行7d，由定位航行和空间探索两部分组成。(1)定位航行—获得性训练：将小鼠在水迷宫中连续训练4d，分别从四个象限进入水迷宫，每次实验间隔5min。若60s内小鼠找到平台且在平台上保持1s时，系统即停止记录，否则小鼠由操作者引导到平台，在平台上休息10s后再进行下一次实验。小鼠在四个起始位置找到平台的平均时间记为逃避潜伏期，评价小鼠学习能力。(2)空间探索：第5天撤除水下平台，将小鼠远离原先的平台象限面向池壁放入水池，统计60s内小鼠穿越平台原先位点的次数、目标象限的游泳时间和游泳距离的百分比，评价小鼠记忆能力。(3)定位航行—反向空间：第6～7天，将平台放置于原先平台的对侧象限，对小鼠进行获得性训练。检测方法同获得性阶段，用于评价小鼠学习能力精确度。

1.6 免疫荧光检测 小鼠连续5d腹腔注射BrdU(50mg/kg, Sigma-Aldrich)。第一次接种BrdU 2d后进行新增殖细胞BrdU+检测；第7天检测新分化神经元BrdU+/DCX+检测。小鼠经10%水合氯醛深度麻醉，顺序灌注生理盐水和4%多聚甲醛，取出脑组织，用冰冻切片机(ThermoHM525NX)自脑冠状面切成40μm厚的漂片。从一个随机切片开始选取脑片，且涵盖整个海马生理结构。脑片用0.01M PBS漂洗后，用含0.25% Triton X-100的1%BSA于37℃水浴封闭30min，一抗孵育2h后4℃过夜，PBS漂洗3次后用二抗孵育2h，再漂洗3次，将脑片裱于防脱载玻片上，甘油/PBS(1∶1)封片剂封片，待激光共聚焦扫描显微镜拍照。

2 结果

2.1 旷场行为学检测结果 小鼠经丰富环境连续饲养8周后，结果如图1所示。与对照组相比，AD组的水平运动次数、直立次数和理毛次数均显著减少，而经丰富环境饲养后的AD小鼠水平运动次数、直立次数和理毛次数均得到显著提高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

2.2 水迷宫行为学检测结果 小鼠经丰富环境连续饲养8周后，结果如图2所示。与对照组相比，AD组逃避潜伏期显著提升，穿平台次数、目标象限时间百分比、目标象限距离百分比显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。而经丰富环境饲养后的AD小鼠，逃避潜伏期显著降低，穿平台次数、目标象限时间百分比、目标象限距离百分比显著提升，且与对照组相比无显著差异(P>0.05)。

图1 EE连续饲养8周后，实验组与对照组旷场行为结果

注：A.与对照组相比，AD组水平运动次数显著降低(**P<0.01)，与AD组相比，EE+AD组水平运动次数显著提高(#P<0.05)； B. 与对照组相比，AD组直立次数显著降低(*P<0.05)，与AD组相比，EE+AD组直立次数显著提高(#P<0.05)； C.与对照组相比，AD组理毛次数显著降低(*P<0.05)，与AD组相比，EE+AD组理毛次数显著提高(#P<0.05)。

图2 EE连续饲养8周后，实验组与对照组水迷宫结果

注：A.与对照组相比，AD组逃避潜伏期明显升高(*P<0.05)，EE+AD组逃避潜伏期无显著差异(P>0.05)； B.与对照组相比，AD组穿平台次数显著降低(*P<0.05)，EE+AD组穿平台次数无显著差异(P>0.05);C.与对照组相比，AD组目标象限时间百分比显著降低(*P<0.05)，EE+AD组目标象限时间百分比无显著差异(P>0.05)；D.与对照组相比，AD组目标象限距离百分比显著降低(*P<0.05)，EE+AD组目标象限距离百分比无显著差异(P>0.05)。

2.3 小鼠海马区免疫荧光表达结果 小鼠经丰富环境连续饲养8周后，与对照相比，AD小鼠海马区BrdU阳性细胞和BrdU/DCX双标阳性细胞显著降低。而与饲养在普通环境的AD小鼠相比，饲养在丰富环境下的AD小鼠海马区BrdU阳性细胞和BrdU/DCX双标阳性细胞显著提升，且差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 EE连续饲养8周后，小鼠海马区BrdU+及BrdU+/DCX+表达情况

注：A.对照组海马区BrdU+细胞分布；B. AD组海马区BrdU+细胞分布；C. AD+EE组海马区BrdU+细胞分布；D.与对照组相比，AD组海马区BrdU+细胞数显著降低(*P<0.05)，与AD组相比，AD+EE组BrdU+细胞数显著提升(#P<0.05)；E.对照组海马区BrdU+/DCX+细胞广泛分布；F.AD组海马区BrdU+/DCX+细胞分布；G.AD+EE组海马区BrdU+/DCX+双标细胞分布；H.与对照组相比，AD组BrdU+/DCX+细胞数显著降低(**P<0.01),与AD组相比，AD+EE组BrdU+/DCX+细胞数显著提升(#P<0.05)。

3 讨论

AD的首要症状是记忆力衰退，随着疾病进展，会出现认知障碍[4]，严重影响日常生活。目前，治疗AD的一线药物胆碱酯酶抑制药和美金刚虽有一定疗效，但不良反应多。干细胞疗法虽然在动物研究中表现出较好的治疗AD的潜力，但是临床应用受限，还会增加额外风险[5]。丰富环境是由多种无生命物和社会刺激组成的复合体。大量动物行为学研究表明丰富环境饲养的AD小鼠表现出较强的活动能力和较好的学习记忆能力，说明其可以改善AD小鼠的行为[6]。丰富环境还可通过增加脑内可塑性相关因子表达，促进大脑海马神经发生。Mirochnic等[7]通过动物模型证实丰富环境可增加小鼠海马齿状回(DG)与学习记忆和情绪调节有关的新生颗粒细胞。对其他神经退行性疾病，如在帕金森病模型小鼠中，发现丰富环境可改变其黑质微环境，促进胶质和神经元再生。因其安全、无创等优点，现已成为延缓AD病程的一个重要简便手段。

旷场行为学是通过动物对新环境的趋向性来评价动物自发活动、探索学习、焦虑等行为的经典方法[8]。实验结果表明丰富环境可以缓解AD小鼠的焦虑症状。水迷宫行为学是与海马突触可塑性密切相关的可靠检测方法，作为研究AD行为的经典实验广泛应用于啮齿类动物的空间航行和记忆能力的研究[9]。实验结果显示，丰富环境能明显改善AD小鼠的空间记忆和学习记忆能力。

神经发生是指成年哺乳动物脑部的神经干细胞在适宜环境下产生新生神经细胞的过程。大量研究证实，通过促进新生神经元产生，可改善学习记忆能力[10]。DCX(doublecortin)是神经前体细胞和未成熟神经细胞表达的一种微管相关蛋白，主要在哺乳动物大脑的DG和侧脑室壁中表达很高。本实验通过BrdU特异性标记具有增殖分化潜能的新生细胞，BrdU/DCX特异性标记新生神经元，检测小鼠海马区的神经发生，实验结果表明其能促进AD小鼠的神经发生。

综上所述，丰富环境可以改善AD小鼠的行为和学习记忆能力，促进神经发生，缓解AD症状。考虑到上述结果，我们推测发生这一系列改变，可能是由于丰富环境诱导了更多的神经元细胞增殖，神经发生的增多促进了神经元突触间信号传递，进一步在小鼠认知功能等行为学上得到体现。而在这过程中，突触间的关键信号蛋白如何改变，还有待进一步探究。