广西壮族自治区耐多药结核分枝杆菌耐药情况与基因型特征分析

梁小烟 林玫 梁大斌 蓝如束 覃慧芳 叶婧 黄莉雯

据全国第五次结核病流行病学抽样调查报告显示，我国结核病总耐药率为42.10%，耐多药(multidrug-resistant, MDR)发生率为6.8%，虽较2000年有所下降，但仍高于全球平均水平，耐药形势不容乐观[1]。北京基因型作为全球第二大流行菌株，与INH、RFP、EMB耐药的发生呈正相关，与MDR的发生呈强相关[2-3]。间隔区寡核苷酸基因分型(Spoligotyping)技术是鉴定北京基因型的金标准，但其所耗时间较长，容易造成交叉污染且易出现人为判读错误；而熔解曲线间隔区寡核苷酸基因分型(melting curve analysis-based Spoligotyping，McSpoligotyping)是一种新型的基因分型技术，与传统的Spoligotyping相比，不仅大大缩短了实验时间，也避免了由于人工判读而导致的错误；同时其结果的准确率也较高，可用于结核病的流行病学研究[4]。广西壮族自治区(以下简称“广西”)位于我国西南地区，由于其特殊的地理位置，结核病和MDR-TB 疫情一直处于全国较高水平[5-6]，严重制约着广西的经济发展，然而关于广西MDR-MTB基因型与耐药性的关系鲜有报道。因此，本研究采用McSpoligotyping分型技术对收集到的MDR-MTB菌株进行基因分型，了解其耐药情况和基因型分布特征，同时分析基因型与耐药的关系。

材料和方法

一、菌株来源

采用连续监测的方法，选取位于广西境内东、西、南、北、中的贵港市、百色市、崇左市、桂林市、防城港市5个市为监测点，采用随机数字表法抽取5个市中的21个县(市、区)，纳入于2016—2017年在当地结核病防治(简称“结防”)机构登记治疗且培养阳性的MTB菌株，共1514株，将菌株送往广西疾病预防控制中心结核病防治所进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)，最终有51株确定为MDR-MTB菌株，其中贵港市12株(23.53%)、百色市9株(17.65%)、崇左市18株(35.29%)、桂林市5株(9.80%)、防城港市7株(13.73%)。

二、研究方法

(一)药敏试验

采用WHO[7]推荐的比例法进行药敏试验，本研究共检测6种药品，包括异烟肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、链霉素(Sm)、氧氟沙星(Ofx)和卡那霉素(Km)。

(二)DNA提取(煮沸法)

取带螺旋盖的前处理管，加入500 μl灭菌生理盐水；用接种环在固体培养基上刮取1～2环MTB加入前处理管中；使用80 ℃水浴灭活30 min后，12 000×g离心5 min；弃上清液，然后加入200 μl三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸缓冲液(TE)重悬菌体；置于100 ℃金属浴中15 min，取出后12 000×g离心10 min后取其上清液置于洁净的EP管中备用。

(三)McSpoligotyping基因分型

1.操作步骤：每份样本分为3管进行检测，分别加扩增试剂McSpoligotyping PCR Mix(A/B/C)。先按照每个样本19.75 μl McSpoligotyping PCR Mix(A/B/C)+0.25 μl McSpoligotyping酶的比例混合PCR反应液，混匀后3000×g离心5 s，然后抽取20 μl离心后的3种PCR反应液分装于PCR薄壁反应管中，最后加入5 μl DNA样本或阴/阳性对照品后置于PCR仪中进行扩增。

2.PCR扩增条件和熔解曲线分析：50 ℃ 5 min→95 ℃ 10 min→(95 ℃ 15 s→57 ℃ 15 s→72 ℃ 15 s)×50个循环→95 ℃ 1 min→35 ℃ 1 min→35 ℃～90 ℃ 以0.04 ℃/s的速率升温时进行熔解曲线分析，并采集羧基荧光素(FAM)、羧基罗丹明(ROX)、六氯荧光素(HEX)和吲哚二碳菁(CY5)四个通道的荧光信号。

3.结果判读：本研究共检测43个间隔子，判读规则见文献[8]。将数据表提交至国际数据库MIRU-VNTRplus (https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces)和SpolDB4.0数据库进行比对。

三、统计学处理

采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，计数资料的比较采用卡方检验或Fisher确切概率法，以P<0.05为差异有统计学意义，均为双侧检验。

结 果

一、耐药情况

51株MDR-MTB菌株中，有21株对EMB耐药，16株对Sm耐药，15株对Ofx耐药，1株对Km耐药，耐药率分别为41.18%、31.37%、9.80%和1.96%。耐药形式共9种，包括耐INH+RFP、耐INH+RFP+Sm、耐INH+RFP+EMB、耐INH+RFP+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB、耐INH+RFP+Sm+Ofx、耐INH+RFP+EMB+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB+Ofx、耐INH+RFP+Sm+EMB+Ofx+Km，其包含的菌株数分别为23株(45.10%)、4株(7.84%)、4株(7.84%)、2株(3.92%)、5株(9.80%)、1株(1.96%)、6株(11.76%)、5株(9.80%)和1株(1.96%)。

二、基因分型

McSpoligotyping将51株MDR-MTB菌株分为北京和非北京基因型两大类，其中北京基因型29株(56.86%)，非北京基因型22株(43.14%)。非北京基因型包括T家族(含6株T1、4株T2和1株T4)11株(21.57%, 11/51)、U家族2株(3.92%, 2/51)、MANU家族(MANU2)1株(1.96%, 1/51)和新发现基因型8株(15.69%, 8/51)。将获得的基因分型结果与SpolDB 4.0数据库进行比对，有43株被分为18种型别且有对应的系统集成测试(SIT)编码，典型北京基因型(SIT=1)占所有菌株的37.25%(19/51)，有8株未找到相对应的SIT编码，为本研究新发现基因型。见表1。

表1 51株耐多药结核分枝杆菌McSpoligotyping基因分型结果

续表1

表2 广西耐多药结核分枝杆菌基因型与耐药情况的相关性

注a：表示采用Fisher确切概率法

三、基因型与耐药情况相关性

北京基因型和非北京基因型菌株对EMB、Sm、Ofx、Km耐药情况比较见表2，结果显示差异均无统计学意义。

讨 论

MDR-TB是全球结核病防控的主要威胁，由于其治疗效果不佳，耐受性差，且治疗费用较高，因此MDR-TB患者，特别是并发糖尿病和年龄较大者，更有可能导致不良治疗结局和死亡[9-10]。关于MDR-TB的相关研究一直以来都是全球关注的热点。本研究对收集到的MDR-MTB菌株进行了药敏试验，结果发现MDR-MTB对EMB、Sm、Ofx、Km的耐药率分别为41.18%、31.37%、9.80%和1.96%。对EMB的耐药率虽低于全国水平(58.7%)[11]，但明显高于海南省(27.34%)[12]、乌鲁木齐市(31.0%)[13]和广西以往的报道(21.7%)[14]。EMB作为一线抗结核药品，是初、复治结核病的常规药品，其耐药率的增加势必会对结核病的治疗效果产生影响，因此应加强对EMB耐药性的监测。而对Sm、Ofx、Km的耐药率低于广西以往的报道(53.9%、44.2%和5.6%)[14]，也低于海南省(54.69%、51.56%和10.94%)[12]，提示Sm、Ofx和Km对MDR-TB仍有一定的治疗价值，但仍需加强对其耐药性的监测。耐药形式以耐INH和RFP最为多见，与周云等[12]、喻容等[15]研究结果一致，也与以往的报道一致[14]。

北京基因型是多个国家和地区的优势菌株，导致了MDR-TB的暴发，一直以来都备受全球关注[16]。本研究采用McSpoligotyping对收集到的51株MDR-MTB菌株进行了基因分型，结果发现北京基因型占56.86%，略低于以往的报道(58.29%)[17]，低于福建省(67.23%)[16]、河南省(83.53%)[18]和陕西省(86.21%)[19]，而略高于四川省(55.73%)和贵州省(55.13%)[17]，进一步体现了北京基因型的分布具有地区差异，表明北京基因型是广西MDR-MTB的主要流行菌株，因此在今后的研究工作中，应加强对该基因型菌株的相关研究，进一步了解其流行和传播规律，以便更好地控制MDR-TB的流行。本研究发现，非北京基因型菌株占43.14%，包括T、U、MANU家族及新发现基因型，其中T家族所占的比例最大。T家族主要流行于中南美洲地区，而在本研究中，T家族占非北京基因型的50.00%，这可能与广西地处中越边境、西南大通道和东盟桥头堡等特殊地理位置，对外贸易频繁，人口流动性较大有关，提示应加强对流动人口结核病的筛查和管理力度。新发现基因型菌株占全部菌株的15.69%，有待做进一步的研究。

虽然有资料报道北京基因型与INH、RFP、Ofx等药品耐药有关，与MDR呈强相关[2-3]，但一项关于中国南方地区MTB北京基因型与耐药相关性的研究结果却显示[20]，尽管北京基因型对任一药品的耐药率均高于非北京基因型，但除Sm外，其他药品耐药与否与是否为北京基因型不相关。本研究发现北京基因型对EMB、Sm、Ofx、Km的耐药率均高于非北京基因型，但差异均无统计学意义，与以往的报道一致[17]，也与林淑芳等[16]、Liu等[21]研究结果一致。由此可见，北京基因型与耐药的相关性存在争议，这可能是由于地区差异而引起，也有可能与本研究所收集到的样本量较少有关。因此下一步应扩大样本量以发现广西北京基因型与耐药的可能相关性。

综上所述，广西MDR-MTB对EMB的耐药率较高，应加强对该药品的监测，此外还应关注MDR-MTB 对其他药品的耐药性。北京基因型为主要流行菌株，与EMB、Sm、Ofx、Km耐药无统计学关联。该结论对广西MDR-TB的防控措施的制定有一定的指导作用。当然，本研究尚存在不足之处，即未对其他常用药品(如吡嗪酰胺、左氧氟沙星等)进行药敏试验，未能评估北京基因型与其他药品耐药的相关性，且由于样本量较少未能对该地区MDR-MTB基因型与社会人口学资料(如性别、年龄等)、人口流动性、疾病进展等的相关性进行深入探讨，这也将成为下一步的研究工作。