125I 放射性粒子对人肺鳞癌H520 细胞荷瘤裸鼠VEGF表达的影响

刘登尧，李建邦，黄伍奎，杨树法，樊喜文

（新疆医科大学附属肿瘤医院 介入诊疗科，新疆 乌鲁木齐）

0 引言

组织间内照射治疗作为非小细胞肺癌（Non-Small Cell Lung Cancer, NSCLC）的一种辅助治疗手段，对于经传统放化疗后效果不佳的患者，是一种较好的局部治疗选择[1]。125I粒子组织间近距离治疗可通过持续释放低剂量率射线造成物理损伤有效控制局部肿瘤，同时刺激分泌各种细胞因子启动细胞凋亡，抑制血管内皮细胞生长[2]。本研究探讨125I 粒子抑制人肺鳞癌裸鼠移植瘤生长的作用机制，旨在为临床提供一定的实验依据。

1 资料与方法

1.1 资料

肺癌细胞株H520（上海名劲生物科技有限公司），健康雄性BALB/c 裸鼠20 只，体重20.0～25.0 g。125I 粒子，6711-99 型，粒子长4.5 mm，直径0.8 mm，活度分别为22.2 MBq、0 MBq（空源粒子），半衰期59.43 d。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

复苏H520 细胞，混匀制成细胞悬液，置于37 °C、5%CO2培养。

1.2.2 裸鼠移植瘤建模

实验前24 h 禁食，自由饮水。取对数生长期的H520 细胞制成浓度为1×107细胞/100 μL 的单细胞悬液，取100 μL接种于裸鼠右上肢皮下，每两天用游标卡尺测量移植瘤长短径。当体积达1000 mm3时建模成功，进行粒子植入。

1.2.3 动物分组及粒子植入

按随机数字表法将模型裸鼠平均分为实验组和对照组。造模成功后，瘤体体积达1 cm3进行粒子植入，实验操作者做好射线防护，用徒手穿刺植入法，将放射性粒子植入移植瘤内。根据实验设计不同，实验组和对照组分别植入活度为22.2 MBq 和0 MBq 的粒子各1 颗。各组动物分笼饲养。

1.3 移植瘤生长情况

分别于粒子植入前、粒子植入后直至第30 天，期间每隔2 d 测量肿瘤的长径（A）和短径（B），按公式计算肿瘤相对体积（V）=A×B2/2，观察两组的体积曲线变化趋势[3]，在皮下移植瘤体积达1000 mm3时用乙醚麻醉裸鼠后处死，移植瘤置于-80 ℃中保存。

1.4 VEGF 蛋白表达

常规制备移植瘤组织切片，脱蜡，水洗。抗原修复：高压修复：锅内倒入0.01 M 柠檬酸钠缓冲液，温度调到最大，高压锅置气后开始计时2 min45 s，脱蜡至水：脱蜡液Ⅰ 20 min，脱蜡液Ⅱ 20 min，脱蜡液Ⅲ 20 min，脱水后放入80%乙醇浸泡8 min，水洗。抗原修复：高压修复：锅内倒入0.01 M 柠檬酸钠缓冲液，温度调到最大，高压锅置气后开始计时2 m i n 4 5 s，自然冷却。灭活：将处理后的组织玻片擦干，滴加内源性过氧化物酶阻断剂，置于室温（25 ℃）避光处理10 min 后，PBS 洗。一抗孵育：将处理后的组织玻片擦干，每张片子加150 μL 抗体（抗体用专用稀释液稀释，含血清），37 ℃孵育1 h，后PBS 洗。滴加增强酶标羊抗小鼠/兔IgG 聚合物，室温静置20 min，PBS 洗。DAB 显色3 min，水洗。复染后脱水：80%乙醇5 min，95%乙醇5 min，无水乙醇5 min，透明液Ⅰ5 min，透明液Ⅱ5 min。中性树胶封片。镜下观察，当视野中细胞内出现棕黄色深染颗粒为阳性。半定量结果分析：在20 倍镜视野测量相对灰度值，相对灰度值=（背景灰度值-实测灰度值）[4]，值越小，代表该蛋白表达越高。

1.5 VEGF mRNA 表达

采用荧光定量PCR 法检测移植瘤组织VEGF mRNA表达。mRNA 相对表达量运用ABI7500 软件（美国应用生物系统公司）进行分析，采用法。RNA 反转录后扩增（Roche Lightcycler 480 Ⅱ）。引物、内参序列以及反应条件，如表1 所示。

表1 引物序列

1.6 数据处理统计分析

2 结果

2.1 肿瘤生长情况

经大体观察测量，实验组与对照组瘤体生长趋势均稳定增长，实验组从125I 粒子植入后第10 天开始，肿瘤体积增长速度开始放缓，在第20 天后直至第30 天实验组的生长曲线更为平坦，与对照组曲线的差距比逐渐增大。

2.2 VEGF 蛋白表达

免疫组化检测实验组与对照组人肺鳞癌H520 细胞移植瘤组织中VEGF 蛋白的表达水平。结果显示，在30 d 后对照组和实验组瘤组织免疫组化切片中VEGF 均有阳性表达（胞质和细胞表面呈深棕色）。但两组表达情况有不同，经进一步分析发现对照组VEGF 阳性表达水平明显高于实验组，相对灰度值为（130.7±9.2）（92.7±7.2）。

2.3 VEGF mRNA 表达

荧光定量PCR 实验结果，在粒子植入后30 d，实验组、对照组VEGF mRNA 表达情况不同，经数据转换后分别为（0.279±0.065）（0.923±0.088）（P＜0.05）。

3 讨论

放射性粒子植入在国外批准应用于前列腺癌的治疗。作为一种局部近距离内照射放疗经我国学者引进后，经过多年努力和改进，配合各种辅助引导方式，目前该治疗技术正广泛地应用于体部各部位实体恶性肿瘤的临床治疗，越来越多的患者从中获益[5]。125I 粒子的有效辐射距离约为1.7 cm，因此它具有靶区内高剂量、靶区外低剂量的特点，可以避免对周围正常组织和器官的影响。我们团队前期的临床研究发现，放射性粒子联合静脉标准化疗方案用于不可手术的晚期非小细胞肺癌患者，相较于单独使用化疗的患者，联合治疗组局部控制率高（78.4% vs 56.4%），1 年生存率高（66.7% vs 45.3%），两组不良反应发生率无明显差异，提示粒子治疗具有良好的近期疗效和安全性，但患者能否从粒子治疗中获得长期生存仍需进一步研究[6]。由于粒子治疗的生物学特性，许多学者对其抑瘤生长机制开展大量研究。众所周知，血管内皮生长因子（VEGF）通过与特征性受体（VEGFR）相结合，激活下游信号通路，介导级联反应促进血管新生过程[7]。本次研究结果显示，具有放射活度的粒子植入荷人肺鳞癌H520细胞裸鼠移植瘤后，实验组VEGF 表达水平降低（P＜0.05），表明放射性125I 粒子可在蛋白和基因水平降低人肺鳞癌组织VEGF 表达。同姚传山等的研究结果类似[8]。此外，本研究观察到实验组植入22.0 MBq 活度粒子后，在30 d 的实验观察期内移植瘤体积生长速度逐渐减慢，但经过分析，两者差异并无统计学意义（P＞0.05），推测可能实验设定观察期较短，未达到粒子的自然半衰期所致，部分研究发现延长实验时间超过半衰期时，可观察到体积差异存在统计学意义[9-13]。

综上所述，放射性125I 粒子可抑制人肺鳞癌H520 细胞荷瘤裸鼠移植瘤的生长，在蛋白水平和基因水平均能抑制VEGF 的表达，推测粒子治疗可能通过影响该因子的表达发挥抑制肿瘤生长[14-15]。