海洋酸化对颗石藻生理特性的影响*

黄书杰 徐 东 王东升 张现盛 叶乃好

海洋酸化对颗石藻生理特性的影响*

黄书杰1,2,3,4徐 东4王东升4张现盛4叶乃好4①

(1. 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心 上海 201306; 2. 上海海洋大学 中国科学技术部海洋生物科学国际联合研究中心 上海 201306; 3. 上海海洋大学 水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室 上海 201306; 4. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 农业农村部海洋渔业可持续发展重点实验室 青岛 266071)

CO2浓度升高引起的海洋酸化对海洋生物尤其是钙化生物颗石藻产生了很大的影响。然而，有关颗石藻对CO2浓度升高响应的研究多集中在单一的品系上，并且在种内或者种间产生了差异甚至相互矛盾的结果。本研究中，分别以赫氏颗石藻()和大洋球石藻() 2种颗石藻的钙化和非钙化的4个品系藻种为研究对象，设置了400、750、1000、2000 µatm共4个CO2浓度梯度，同时进行分批充气培养，系统研究了海洋酸化对颗石藻的生长光合、氮源吸收、元素组成和钙化效率等生理影响。结果显示，随着CO2浓度升高至2000 µatm，不同的颗石藻并未有一致的反应。除了非钙化的(N-E)外，其他3个品系颗石藻的生长和颗粒有机碳产率都对CO2增加表现出积极的响应；随着CO2浓度的升高，4种品系颗石藻的光合参数v/m、(Ⅱ)和叶绿素含量呈整体下降趋势；CS369 (C-E)和(C-G)在第7天的钙化效率分别下降了35.4%和68.9%；此外，4种品系颗石藻的颗粒有机氮产率都出现增加趋势，而POC/PON和PIC/POC均呈现下降趋势。本研究确定了海洋酸化对颗石藻的不同生理影响，这种差异影响可能会导致未来海洋生物多样性的改变和其他生态系统进程的变化。

海洋酸化；颗石藻；特异性；生物多样性

浮游植物在海洋食物网和生物地球化学循环中起着至关重要的作用(Falkowski, 2012)。颗石藻作为一种单细胞定鞭藻类，其细胞表面覆盖着细胞内产生的方解石小板，是目前海洋中数量最多、分布最广的钙化浮游生物类群之一(Langer, 2009; Langer, 2013; Lohbeck, 2014; Young, 2014)。此外，颗石藻参与形成的碳酸盐泵，在碳生物地球化学循环中发挥着重要作用；颗石藻能够形成大规模的赤潮，这些特征被认为对全球气候变化有反馈作用(Hutchins, 2011; Riebesell, 2011; Jin, 2013; Beaufort, 2014)。然而，大气CO2浓度的增加引起的海洋酸化正在导致海洋表层pH值下降(预计到2100年和2300年分别减少0.5和0.7个单位)(Caldeira, 2003; IPCC, 2008; Ross, 2011)，同时改变碳酸盐系统(Beaufort, 2010)。表层海水的这些变化对颗石藻和其他钙化藻种产生了巨大的影响，预计将影响整个群落和生态系统，甚至破坏整个海洋环境(Turley, 2010; Hoppe, 2011; Sinutok, 2011; Lohbeck, 2012; Meier, 2014)。

过去十年间，许多有关实验室培养和大型半封闭野外培养(中试实验)的研究，都集中在单种颗石藻对海洋酸化的响应，这产生了不一致甚至相互矛盾的结果(Young,2014)。Riebesel等(2000)发现，随着CO2浓度的增加，颗石藻的钙化作用明显减弱，同时伴随着颗粒有机碳(POC)的增加。随后对单一藻种赫氏颗石藻()的研究也表明，海洋酸化导致该物种的钙化效率降低，但POC产量发生不均一(增加、减少或不受影响)变化(Zondervan,2002; Sciandra,2003; Delille,2005; Feng,2008; Müller,2010; Hoppe, 2011)。许多其他关于藻株应对海洋酸化的研究也显示相互矛盾的结果，例如，颗石藻钙化率的不断增加(Iglesias-Rodriguez,2008; Shi,2009; Jones, 2013)或不敏感变化(Langer, 2009; De Bodt, 2010; Fiorini,2011b)。

此外，前人研究的3种钙化颗石藻(,,)，都对CO2浓度升高表现出不同的响应模式。例如，CO2浓度升高使PC7/1的钙化效率大幅下降44.7% (Riebesell, 2000)，4762藻株的钙化率则表现出轻微增加(Rickaby,2010)，而AC370藻株反应不敏感(Fiorini, 2011b)。鉴于这种矛盾的结果，已经出现了一些同时测试不同颗石藻品系或种类的研究(Langer, 2006、2009; Fiorini, 2011b)。Langer等(2009)指出，先前海洋酸化研究中使用的不同赫氏颗石藻品系的敏感性在本质上是不同的，这可能是由于存在特异性反应的遗传基础所致。

过去有关海洋酸化对颗石藻钙化作用影响的研究结果是不一致的，利用这些研究结果，在日益酸化的海洋环境中，准确预测未来颗石藻的命运仍然存在着问题。此外，基于短期实验的海洋表层优势种赫氏颗石藻对海洋酸化的响应也得到了深入的研究，文献范围也在迅速扩大。Langer等(2006)指出，单一品系颗石藻得到的实验结果，可能会对很好适应当前CO2条件的不同颗石藻在应对未来可能发生的海洋酸化的响应研究产生偏差，而且实验结果存在着缺乏普遍有效性的问题。此外，由于非钙化的颗石藻藻种在海洋生态系统中发挥着重要的生态作用，非钙化藻株的研究不应该被忽视，并且最近受到越来越多的关注(Kottmeier, 2014)。因此，当下需要同时研究更多不同的颗石藻品系，并研究CO2浓度升高对颗石藻的长期生物学效应。

本研究将CO2浓度从400 µatm升高到2000 µatm，来分别模拟当今和未来海洋酸化条件。同时，利用颗石藻的2个优势种赫氏颗石藻和大洋球石藻，包括非钙化的和钙化的品系，进行一系列实验。通过测定颗石藻的细胞密度、藻体光合参数、氮吸收速率、颗粒无机碳(PIC)产量、颗粒有机碳(POC)产量、颗粒有机氮(PON)以及它们之间的比率等生理参数，以分析不同品系颗石藻在不同CO2浓度下的潜在生理变化。此外，拟合了4个品系颗石藻相对于CO2变化的氮吸收速率响应曲线，并应用响应曲线中的动力学常数进一步分析4种品系颗石藻之间的本质响应差异。这些结果旨在了解类似条件下海洋酸化对不同颗石藻的差异影响，有助于评估未来环境条件下生物多样性和其他生态进程的改变。

1 材料与方法

1.1 实验材料和培养条件

实验所用的钙化和非钙化的赫氏颗石藻(简写为N-E;CS369, 简写为C-E)以及钙化和非钙化的大洋球石藻(NIES-1318, 简写为N-G;, 简写为C-G)均来源于中国水产科学研究院黄海水产研究所微藻培养中心。藻细胞在天然过滤海水(0.22 µm)培养基中培养，海水中硝酸盐和磷酸盐的浓度分别为882 µmol/L和36.2 µmol/L，根据f/2培养基向海水中添加金属和维生素(Guillard, 1962)。细胞培养在含1 L培养基的2 L三角烧瓶中，放置在植物培养箱中，培养温度为20℃，盐度为32。培养光源为白色荧光灯，光强为300 µmol/m2∙s，光暗比为16 h/8 h，实验采用处于指数生长期的颗石藻。

1.2 实验内容及方法

1.2.1 实验设置 采用与Xu等(2014)类似的方法，在植物培养箱(GXZ，瑞华，武汉)中，将空气与CO2混合，向4种品系颗石藻泵入不同CO2分压的空气，设3个重复的1000 ml培养物进行培养。在准备阶段，在上述条件下，4种品系颗石藻被分别培养到指数生长期。在培养基中用含有不同CO2分压的空气连续充气，以提供400、750、1000和2000 μatm的CO2，各项初始值见表1。待持续充气48 h稳定后，进行下一步实验。每次实验中，每个空气–CO2混合物均设3份平行样，以不添加细胞的实验体系作为空白对照，分别监测细胞密度和pH值。在取样点分别测定叶绿素含量、PIC、POC、DIC和碱度。

1.2.2 碳酸盐体系分析 培养基pH值采用pH计检测(Orion ROSS, Thermo Electron Corp., 美国)。总碱度(TA)用Whatman GF/F膜过滤，储存在密封的100 ml三角烧瓶中，放置在-20℃，使用848自动滴定仪(Metrohm, Riverview, FL, 美国)获得总碱度值。利用CO2SYS包获得海水中碳酸盐体系的pH、温度、盐度和TA，其中碱度根据Pelletier等(2007)提供的方法计算。

1.2.3 生长测定 在光学显微镜(Nikon，日本)下用血细胞计数器手动计数，获得准确的细胞数以估算微藻的生长情况。利用如下公式测定比生长速率()：

=(ln1-ln0)/(1-0)

式中，0和1分别是初始时间0和随后时间1的藻细胞浓度。

1.2.4 叶绿素荧光参数的测定及色素分析 使用Dual-PAM-100(Walz, Effeltrich, 德国)测定颗石藻的叶绿素荧光参数。测量前将样品暗适应15 min，在弱光下测定初始荧光(0)。暗适应后的样品在饱和脉冲光下获得最大荧光值(m)。¢m代表被照亮后样品的m产量，t是实时荧光产量。根据公式v/m=(m-0)/m计算最大PSⅡ量子产额(v/m)。有效PSⅡ量子产率计算：(Ⅱ)=(¢m-t)/¢m。

为了确定色素含量，样品被过滤收集到GF/F过滤膜(25 mm)上，然后在4℃的黑暗条件下，用10 ml的90%丙酮提取24 h，7000 g离心10 min后，上清液用于室温下色素含量分析。叶绿素含量采用Jeffrey等(1975)的方法测定。

1.2.5 氮吸收速率的测定 每个实验体系收集5 ml水样，迅速用醋酸纤维素膜过滤，置于聚乙烯离心管中，冷冻保存于-80℃。营养盐分析前，将样品解冻至室温，用营养盐自动分析仪(Bran and Luebbe AA3, 德国)对硝酸盐浓度进行光度分析。氮吸收速率计算公式：NUR=(0-t)//，NUR为氮吸收速率(pmol of nitrate∙N/cell∙d)，0和t分别为实验开始和第7天硝酸盐浓度(pmol/L)；为水的体积(L)；为细胞数；为时间间隔(d)。此外，使用米氏方程曲线(Michaelis, 1913; Hutchins, 2013)拟合每个CO2浓度下的平行样品关于氮吸收的CO2响应曲线。使用Origin Pro软件进行动力学常数和曲线相关系数的计算。

1.2.6 藻体中碳和氮元素的含量分析 将样品过滤到灼烧过(500℃, 5 h)的GF/F膜(25 mm)，保存在-20℃直到分析。在分析之前，颗粒有机碳的滤膜用浓盐酸熏24 h，除去无机碳，再次干燥。然后将过滤膜装好进行后续分析。POC、PON、TPC浓度由Vario ELⅢ自动元素分析仪(Elemntar Analysensysteme Co., 德国)依次测定。通过TPC与POC的差异，计算PIC浓度，POC、PIC或PON产量计算公式如下：

=比生长速率(d−1)×细胞中POC、PIC或PON含量(pg/cell)。

1.2.7 数据分析 实验数据的统计分析采用SPSS 17.0软件，运用单因素方差分析(One-way ANOVA)来分析各处理之间差异的显著性，以<0.05作为差异显著水平。

2 结果

2.1 实验中碳酸盐体系的变化

本实验采用充气法模拟海水酸化，检测不同处理条件下的海水碳酸盐系统参数的变化，包括pH、DIC、HCO3−、CO32−和CO2。图1和表1为不同颗石藻的海水pH值随CO2浓度的变化情况。浓度为400、750、1000和2000 µatm的CO2对应的pH值分别为8.06±0.02、7.79±0.01、7.65±0.02和7.48±0.02。因为海水中含有引起碱度变化的缓冲液，本研究设定的实验条件与预期的海洋酸化条件并不完全相同。有些实验测量需要大量的生物量，因此，需要较大的细胞密度，从而导致碳酸盐体系的变化。尽管存在这些变化，但在整个实验过程中，培养藻的4种梯度的pH值始终保持着明显的差异，使研究结果具有重要意义。

2.2 海洋酸化对颗石藻生长的影响

实验室条件下，不同CO2分压对4种品系颗石藻生长的影响如图2所示。所有处理的藻细胞浓度随着培养时间的延长逐渐升高并达到最大值，随后，藻细胞浓度逐渐下降直至实验结束。CO2分压对每种颗石藻的细胞浓度均有显著影响。随着CO2浓度逐渐增加，C-E、N-E和N-G均显示出积极响应，然而对于N-E，CO2分压达到2000 µatm时，N-E的生长被抑制。所有处理的藻细胞在前7 d均呈指数级生长，其特定生长速率如图2e~h所示。CO2浓度持续增加至2000 µatm，比生长速率分别增大约53% (C-E)，36% (N-G)和30% (C-G)。然而，对于N-E，当CO2浓度达到1000 µatm，比生长率增加约26%。当CO2连续升至2000 µatm时，与对照组相比，海洋酸化导致N-E的比生长率下降14%。

表1 初始碳酸盐系统参数

Tab.1 The data of the original carbonated system

图1 4种品系颗石藻在不同的CO2浓度下随着培养时间改变的海水pH值变化

[N-E:(a); C-E:CS369 (b); N-G:NIES-1318 (c); C-G:(d)]

2.3 海洋酸化对颗石藻光合特性的影响

图3为海洋酸化对颗石藻v/m和Y(Ⅱ)在内的光系统参数变化的影响。当CO2升高至2000 µatm时，所有处理的v/m和Y(Ⅱ)均显示出负面影响，但响应幅度在4种品系颗石藻中不同。随着培养时间的延长，除了CO2浓度达到2000 µatm时，C-E的参数v/m在第10天达到最大值，N-E一直下降之外，4种品系颗石藻的光合系统参数在第7天达到最大值，随后下降直至实验结束。随着CO2分压增加到2000 µatm，对于N-E、C-E、N-G和C-G，海洋酸化对v/m的显著抑制作用分别发生在第7、4、13和10天，而对Y(Ⅱ)的抑制作用分别发生在第4、13、13和10天。实验结束后，与对照组相比，当CO2分压升高至2000 µatm，v/m被抑制，分别下降60%、45%、55%和46%；Y(Ⅱ)也被抑制，分别下降75%、69%、76%和39%。此外，与N-E和N-G的最大Y(Ⅱ)值相比[低于400 µatm时分别为(0.32±1.90)%和(0.34±2.60)%]，C-E和C-G的最大Y(Ⅱ)值[低于400 µatm时分别为(0.39±3.10)%和(0.48±2.30)%]显著较高，而v/m无显著差异。

图2 不同CO2浓度下4种品系颗石藻的生长曲线(a~d)和比生长速率(e~h)

图3 培养过程CO2浓度升高对4种品系颗石藻的光合参数Fv/Fm (a~d)和Y(Ⅱ)(e~f)的影响

当CO2浓度从400 µatm升高至2000 µatm对不同品系颗石藻细胞内叶绿素含量的影响见图4。细胞叶绿素含量在第20天(N-E、C-E和N-G)和第7天(C-G)达到最大值，在初始值出现微小变化后，叶绿素含量逐渐下降，直至实验结束(图4a~d)。然而，随着时间的推移，叶绿素呈现出整体稳定下降的趋势(图4e~f)。然而，随着CO2浓度从400 µatm增加至1000 µatm，每种颗石藻叶绿素含量以同样模式下降(除了个别点以不同的方式呈现)。然而，当CO2浓度达到2000 µatm时，测定的结果表现出不同的反应。与1000 µatm相比，当CO2浓度为2000 µatm时，在每个采样点，随着培养时间的延长，N-E的叶绿素和的含量降低。然而，对于藻株C-E、N-G和C-G，随着CO2浓度增加到1000 µatm，在每个采样点叶绿素含量趋向于增加。

2.4 海洋酸化对颗石藻氮吸收速率的影响

海洋酸化对4种品系颗石藻氮吸收速率的影响如图5所示。随着CO2从400 µatm升高至2000 µatm，4种品系颗石藻的氮吸收速率均增加，分别增加了48.2%(N-E)、33.9%(C-E)、41.6%(N-G)和34.3%(C-G)。氮吸收速率的最大变异值(48.2%, N-E)比最小变异值(33.9%, C-E)增大了近1.5倍。此外，4种品系颗石藻的氮吸收速率相对于CO2增加的响应根据米氏方程曲线拟合，由响应曲线得到2个半饱和常数(m, µatm CO2)和最大CO2饱和率(max, pmol N/cell∙d)得到。藻体N-E中，最大m和max值分别是307.2 µatm和24.1 pmol N/cell∙d，分别大于C-E最低值约1.7倍和1.3倍。

a:; b:CS369; c:NIES-1318; d:

2.5 海洋酸化对颗石藻元素组成及钙化速率的影响

图6为CO2升高对第7天的4种品系颗石藻的POC和PON的产生情况。当CO2达到2000 µatm时，显著刺激颗石藻产生POC和PON(除了N-E)。N-E颗石藻有机碳生产率的变化是巨大的，在1000 µatm CO2浓度条件下，表现出明显的增加，但在2000 µatm时，表现出大幅下降。与对照组相比，C-E、N-G和C-G藻种的POC产量分别增长约101%、35%和49%，其中C-E品系POC产率变化分别为N-G、C-G品种的2.9倍、2.1倍。此外，在此范围内，PON较对照组分别增加233%(N-E)、289%(C-E)、148%(N-G)和129%(C-G)，增幅较大。然而，随着CO2由400 µatm升高至2000 µatm，4个藻种的颗粒有机碳和氮的变化导致颗粒有机碳与颗粒有机氮的比值(POC/PON)分别减少76.6%(N-E)、48.3%(C-E)、45.7%(N-G)和34.9%(C-G)。此外，与400 µatm CO2相比，2000 µatm CO2对颗粒有机碳的产率有负面的影响，2个钙化品系C-E和C-G的钙化率呈现更大程度的降低，分别为35.4%和68.9%。当CO2浓度增大到2000 µatm，C-G比C-E呈现更高的PIC还原力。同时，这2种藻的PIC/POC值也分别下降67.9%和79.2%。

图6 海水酸化对4种品系颗石藻颗粒有机碳和颗粒无机碳的生产率及碳氮比的影响

3 讨论

本研究首次在实验中使用了非钙化品系和钙化品系的2种颗石藻，研究了它们对CO2升高的响应。同时，利用氮吸收率拟合的CO2响应曲线，获得的动力常数来分析不同颗石藻的遗传变异性。当CO2浓度升高到2000 µatm时，与其他3个藻种不同程度的积极响应相比，N-E被严重抑制。本结果表明，海洋酸化对颗石藻产生生理影响，不同颗石藻对海洋酸化具有特异响应，最近的研究表明，不同的浮游植物对CO2浓度升高的响应存在种间异质性(马莎等, 2019)，这与本研究结果类似。作者推测，海洋酸化可能导致未来海洋生物多样性、营养相互作用关系和其他生态系统进程的变化。

3.1 海洋酸化对不同颗石藻生长和光合系统参数的影响

研究表明，与对照组相比，除了N-E，高CO2浓度(增加到2000 µatm)促进藻细胞的生长(图2)。而N-E的生长在CO2浓度为2000 µatm时下降，其特定生长率在第7天显著降低了7.61%。然而，在CO2浓度升高至1000 μatm之前，N-E的生长保持增长状态(图2a和2e)。Fiorini等(2011b)也得到了类似的结果，富含CO2(750 µatm)的水中，颗石藻藻状细胞的生长呈现增长趋势。

前人的研究表明，由于细胞外碳酸酐酶的活性较低，导致其CO2浓缩机制(CCM)效率相对较低(Herfort, 2002; Trimborn, 2007; Rokitta, 2012a; Jin, 2013)，所以，目前海洋中的颗石藻具有碳限制性。因此，酸化的海水可利用CO2含量的增加可能会加速Rubisco附近CO2的积累，以弥补碳供应不足，进一步促进颗石藻的羧化作用和生长作用(伴随着POC的增加) (Barcelose, 2010; Reinfelder, 2011; Jin, 2013; Kottmeier, 2014)。本研究中，观察到4种品系颗石藻在高CO2条件下的生长情况，N-E在1000 µatm增长23%，另外3种藻在2000 µatm时分别增长53%(C-E)、36%(N-G)和30%(C-G)(图2)。然而，每个品系对CO2升高的反应能力和策略不同。此外，对于N-E来说，在2000 µatm条件下，几乎处于白化状态。

研究表明，细胞外pH值的变化可以通过破坏恒定膜电位平衡和生理参数来影响藻细胞的活性(Langer, 2006; Taylor, 2011; Rokitta, 2012b)。相比于其他3种品系颗石藻，由于pH值下降及超过耐受能力(7.48, 2000 µatm)，N-E更加敏感而呈负反应。因为颗石藻是一种丰富的藻种，具有独特的生理和形态特征(Winter, 1994; Raven, 2012)，推测颗石藻对CO2增加的特异性反应具有遗传基础。Read等(2013)报道了第一次解析的基因组(来自CCMP1516)在复合种内的变异性支持了颗石藻在不同生境中的繁荣发展。结合本实验结果，猜想颗石藻固有的遗传特异性可能导致其对海洋酸化产生特异性反应。

然而，由于光合系统参数和色素含量分析的藻类光合作用(与生长紧密相关)能力随着CO2增加产生多种负反应，尤其N-E几乎丧失光合能力(图3和4)。这些涉及到光系统活动的结果表明，由于pH值下降(CO2升高)对细胞离子平衡的影响，藻细胞仍然处于光合不健康状态(Langer, 2006)，诱导了叶绿素含量降低(图4)。特别是当CO2浓度达到2000 µatm，超过可调节的范围，与其他3种品系颗石藻相比，NE的V/m和叶绿素的含量被严重影响(图3a和4a)。与CO2升高对生长的不同反应相类似，不同藻类光合作用对CO2升高响应也具有特异性。对于整个生态系统来说，一部分的微小变化可能会影响整个生态系统，颗石藻对海洋酸化的特异反应可能会影响生物多样性和其他生态过程(Orr, 2005; Hendriks, 2010)。

3.2 海洋酸化对颗石藻氮吸收速率的影响

考虑到海洋酸化对营养盐吸收的影响，本研究在第7天取样测试了不同CO2水平下各品系藻株的氮吸收速率，并拟合了每种颗石藻应对CO2变化的氮吸收速率响应曲线，以供进一步分析。结果表明，当CO2浓度升高至2000 µatm时，所有品系的氮吸收速率增加(图5)。非钙化藻株N-E和N-G的氮吸收速率显著的增加了41.6%和48.2%(图5a和c)，而钙化藻株C-E和C-G分别在氮吸收速率提高了33.9%和34.3%。Jin等(2013)的研究表明，CO2增加导致颗石藻对无机氮的吸收增强，硅藻硝酸盐还原酶基因上调。此外，各品系藻种之间也存在差异。

先前的研究表明，在海洋酸化条件下，颗石藻细胞具有能量再分配的过程(Raven, 2011; Beaufort, 2011)，导致额外的ATP释放优先支持额外的氮吸收以合成更多的蛋白质(Jin, 2013)。然而，与非钙化细胞相比，钙化细胞需要更多的能量来转运钙化作用中的氢离子到酸性环境中(Suffrian, 2011; Taylor, 2011; Beaufort, 2011; Stojkovic, 2013)。CO2升高到2000 µatm时，钙化品系藻株的氮吸收速率显著低于非钙化藻株。此外，本研究在CO2升高下测定PON产量也间接证实了氮吸收的能量再分配偏好(图6b)。

藻氮吸收速率相对CO2变化的响应曲线，证实了CO2对这些颗石藻的影响行为。由响应曲线推导出的动力学常数(m)表示酶对底物的亲和力，m值越大，亲和力越小(Michaelis, 1913)。最近，Hutchins等(2013)通过分析不同的动力学常数，证实了固氮作用与CO2浓度之间的品系特异性差异。在这项研究中，相比其他3种藻株，N-E显示出最高m值，即NO3还原酶的亲和力最低(图5)。这一结果与其他测量参数，如生长速率、光合活动等反映出相同的趋势，这表明CO2浓度升高严重抑制了N-E的生命活动。

3.3 海洋酸化对不同颗石藻元素组成的影响

浮游植物的化学元素组成会对营养相互作用关系有一定影响，并最终对海洋营养元素的生物地球化学产生影响，因为海洋浮游动物的膳食价值随POC与PON的比值(C∶N)变化而变化(Hutchins, 2009; Anderson, 2013)。本研究测量了不同品系颗石藻的C∶N比例，以评估生物有机体的元素组成是否受到CO2浓度的影响，并探讨了影响的程度。结果显示，在2000 µatm CO2浓度下，4种品系颗石藻的元素组成均发生变化，C∶N分别降低76%(N-E)、48%(C-E)、45%(N-G)和35%(C-G)(图6)。N-E相对其他3种颗石藻的影响较大，C-G的影响最小。在之前的研究中，Fiorini等(2011a)和Rickaby等(2010)的研究表明，当CO2浓度增强时，颗石藻发生了相似的变化。当CO2浓度从400 µatm持续上升到2000 µatm时，POC(除了在2000 µatm下的N-E)和PON的产率增加(图6)。

研究还发现，与对照组相比，PON的增加量比POC要高。前面已经讨论过，由于CO2的升高，能量的重新分配导致了更多的氮吸收，增加了PON产量。尽管不同颗石藻的品系之间存在差异，这种偏好优势使得PON产量超过POC产量，导致C∶N下降的幅度不同(图6)。与Riebesell等(2011)之前的研究结果类似，C∶N比值随着CO2浓度的变化具有高度的物种特异性。此外，这种变异比例可能是不同品系藻株间遗传差异的体现。此外，也存在与目前的研究结果相反的结果，随着CO2浓度的升高，细胞C∶N比值增加(Feng, 2010; Kottmeier, 2014)。

产生矛盾结果的原因可能是实验设置的不同，如温度、光照强度、藻种的选择等。此外，最终结果表现出一种非常有趣的现象，非钙化藻的C∶N比值比钙化藻高。这种现象的原因尚不清楚，但很可能与颗石藻钙化作用有关。这些结果表明，CO2浓度的增加影响了颗石藻C∶N比值，并且对不同颗石藻产生了不同的影响。此外，它还将进一步影响浮游植物的捕食选择压力，并对许多生物地球化学循环过程产生影响(特别是碳输出通量)(Iglesias-Rodriguez, 2008)。

3.4 海洋酸化对颗石藻钙化效率的影响

在过去几年里，颗石藻PIC生产效率(钙化率)已被广泛用于颗石藻的研究，以预测海洋酸化的生物学影响。结果表明，当藻细胞生长在高于当前CO2水平时(400 µatm)，主要反应是钙化率下降或者至少减少PIC/POC的值(Zon-dervan, 2001; Langer, 2006; Muller, 2010; Hoppe, 2011)。本研究中，关于PIC的响应与上述的趋势是一致的。同时，当CO2浓度由400 µatm升高到2000 µatm时，钙化赫氏颗石藻和钙化大洋球藻在第7天的钙化率分别下降35.4%和68.9%(图7)。相比大洋球藻，赫氏颗石藻更容易受海洋酸化的影响，从而导致生态不平衡的因素。但对于实验中所用的非钙化种，由于失去了表面覆盖的钙化外壳，PIC的产量几乎可以忽略不计。

最近各种生物体的研究显示，钙化很大程度上是由饱和碳酸钙而不是单靠pH值控制(Langer, 2006; Trimborn, 2007)。海水中的饱和碳酸钙由(DIC)和pH值共同控制(Iglesias-Rodriguez, 2008)。当表层海水过饱和碳酸钙由于海洋酸化或其他自然过程条件下饱和程度下降时，分布在贝壳和骨骼中的碳酸盐矿物开始溶解(Feely, 2009)。该研究表明，当CO2浓度由400 µatm升高到2000 µatm，钙离子的饱和度降低，但依然处于溶解发生的阈值。结果明确表明，与对照组相比，PIC的产量(钙化效率)最终有所下降(图7)。

Langer等(2009)的研究结果也出现同样的现象，虽然钙离子的饱和度大于1，但颗粒无机碳的溶解仍然发生。为了解释这一现象，我们发现400 µatm和2000 µatm CO2在第7天的pH值介于8.81~7.62之间(表1和图1)，并且与空白对照相比，细胞的生理状态和pH值有一定的变化。这些变化影响了藻细胞的光合作用，这意味着颗石藻细胞不完全适应改变后的pH条件。Bach等(2011)认为，钙化作用对pH值降低具有特异性反应。在CO2升高的情况下，颗石藻的钙化作用是一个严格控制的生物进程(Mackinder, 2010)，将受到pH水平下降的影响。

最近，大量的生理和分子研究证据表明，当使用HCO3–进行钙化作用(产生H+，并保持细胞pH稳态接近中性)时，H+必须通过膜离子通道被清除(Suffrian, 2011; Taylor, 2011)或者在颗石藻细胞中被总和(Fabry, 2008; Rokitta, 2012; Stojkovic, 2013)。为了维持合适的跨质膜电位差和H+射流，H+输运过程中需要能量(Raven, 2011)。当CO2升高导致水体pH值和/或[CO32-]水平降低时，单位钙化输入的能量可能更大，从而导致钙化率降低(Raven, 2011; Beaufort, 2011)。通过研究CO2增加对颗石藻钙化的不利影响，颗石藻的钙化作用与生物地球化学循环密切相关，虽然我们对钙化作用的降低给出了合理的解释，但这种解释只是事实的一小部分。目前，海洋酸化对钙化颗石藻影响的原因仍然需要进一步的探索。

图7 海水酸化第7天对钙化颗石藻的颗粒无机碳生产率以及颗粒无机碳与颗粒有机碳的比值的影响

本研究表明，不同颗石藻在应对海洋酸化威胁时表现出了特异的生理响应，随着CO2浓度的逐渐增加，不同颗石藻在维持稳定的原始状态都发生了不同程度的改变。因此，物种分布和丰度的潜在变化可以通过海洋食物网的多种营养水平传递。虽然海洋酸化对生态系统长期影响的研究还处于起步阶段，但这些结果可能指示出在海洋酸化条件下生物多样性、营养相互作用关系、生物地球化学循环和其他生态系统进程的变化。

Anderson TR, Hessen DO, Mitra A,. Sensitivity of secondary production and export flux to choice of trophic transfer formulation in marine ecosystem models. Journal of Marine Systems, 2013, 125: 41–53

Bach LT, Riebesell U, Schulz KG. Distinguishing between the effects of ocean acidification and ocean carbonation in the coccolithophore. Limnology and Oceanography, 2011, 56(6): 2040–2050

Barcelose RJ, Müller MN, Riebesell U. Short-term response of the coccolithophoreto an abrupt change in seawater carbon dioxide concentrations. Biogeosciences, 2010, 7(1): 177–186

Beaufort L, Barbarin N, Gally Y. Optical measurements to determine the thickness of calcite crystals and the mass of thin carbonate particles such as coccoliths. Nature Protocols, 2014, 9(3): 633–642

Beaufort L, Probert I, Garidelthoron TD,. Sensitivity of coccolithophores to carbonate chemistry and ocean acidification. Nature, 2011, 476(7358): 80–83

Caldeira K, Wickett ME. Oceanography: Anthropogenic carbon and ocean pH. Nature, 2003, 425(6956): 365–365

De Bodt C, van Oostende N, Harlay J,. Individual and interacting effects of pCO2and temperature oncalcification: Study of the calcite production, the coccolith morphology and the coccosphere size. Biogeosciences, 2010, 7(5): 1401–1412

Delille B, Harlay J, Zondervan I,. Response of primary production and calcification to changes of pCO2during experimental blooms of the coccolithophorid. Global Biogeochemical Cycles, 2005, 19(2): GB2023

Fabry VJ, Seibel BA, Feely RA,. Impacts of ocean acidification on marine fauna and ecosystem processes. ICES Journal of Marine Science, 2008, 65(3): 414–432

Falkowski P. Ocean Science: The power of plankton. Nature, 2012, 483(7387): S17–20

Feely RA, Doney SC, Cooley SR. Ocean acidification: Present conditions and future changes in a high-CO2world. Oceanography, 2009, 22(4): 36–47

Feng Y, Warner ME, Zhang Y,. Interactive effects of increased pCO2, temperature and irradiance on the marine coccolithophore(Prymnesiophyceae). European Journal of Phycology, 2008, 43(1): 87–98

Fiorini S, Middelburg JJ, Gattuso JP. Effects of elevated CO2partial pressure and temperature on the coccolithophore. Aquatic Microbial Ecology, 2011, 64(3): 221–232

Fiorini S, Middelburg JJ, Gattuso JP. Testing the effects of elevated pCO2on coccolithophores (Prymnesiophyceae): Comparison between haploid and diploid life stages. Journal of Phycology, 2011, 47(6): 1281–1291

Hendriks IE, Duarte CM, Álvarez M. Vulnerability of marine biodiversity to ocean acidification: A meta-analysis. Estuarine,Coastal and Shelf Science, 2010, 86(2): 157–164

Herfort L, Thake B, Roberts J. Acquisition and use of bicarbonate by. New Phytologist, 2002, 156(3): 427–436

Hoppe CJM, Langer G, Rost B.shows identical responses to elevated pCO2in TA and DIC manipulations. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2011, 406(1): 54–62

Hutchins DA, Fu FX, Webb EA,. Taxon-specific response of marine nitrogen fixers to elevated carbon dioxide concentrations. Nature Geoscience, 2013, 6(9): 790–795

Hutchins DA, Mulholland MR, Fu F. Nutrient cycles and marine microbes in a CO2-enriched ocean. Oceanography, 2009, 22(4): 128–145

Hutchins DA. Oceanography: Forecasting the rain ratio. Nature, 2011, 476(7358): 41–42

Iglesias-Rodriguez MD, Halloran PR, Rickaby REM,. Phytoplankton calcification in a high-CO2world. Science, 2008, 320(5874): 336–340

Intergovernmental Panel on Climate Change (IPCC). Summary for policy makers in climate change 2007: The physical sciences basis, working group I contribution to the fourth assessment report of the IPCC, edited by: Solomon. Cambridge University Press, Cambridge, 2007, 1–996

IPCC (Intergovernmental Panel on Climate Change). The fourth assessment report of the IPCC. Cambridge University Press, 2008

Jeffrey SW, Humphrey GF. New spectrophotometric equations for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton. Biochemie und Physiologie Der Pflanzen, 1975, 167(2): 191–194

Jin P, Gao K, Beardall J. Evolutionary responses of a coccolithophoridto ocean acidification. Evolution, 2013, 67(7): 1869–1878

Jones BM, Iglesias-Rodriguez MD, Skipp PJ,. Responses of theproteome to ocean acidification. PLoS One, 2013, 8(4): 1–13

Kottmeier DM, Rokitta SD, Tortell PD,. Strong shift from HCO3−to CO2uptake inwith acidification: New approach unravels acclimation versus short-term pH effects. Photosynthesis Research, 2014, 121(2–3): 265–275

Langer G, Geisen M, Baumann KH,. Species-specific responses of calcifying algae to changing seawater carbonate chemistry. Geochemistry, Geophysics, Geosystems, 2006, 7(9): 1–12

Langer G, Nehrke G, Probert I,. Strain-specific responses ofto changing seawater carbonate chemistry. Biogeosciences, 2009, 6(11): 2637–2646

Langer G. Palaeontology: Plankton in a greenhouse world. Nature Geoscience, 2013, 6(3): 164–165

Lohbeck KT, Riebesell U, Reusch TBH. Adaptive evolution of a key phytoplankton species to ocean acidification. Nature Geoscience, 2012, 5(5): 346–351

Lohbeck KT, Riebesell U, Reusch TBH. Gene expression changes in the coccolithophoreafter 500 generations of selection to ocean acidification. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 2014, 281(1786): 20140003

Ma S, Zhang JH, Liu Y,. The response of different types of phytoplankton to the elevated CO2concentration. Progress in Fishery Sciences, 2019, 40(1): 27–35 [马莎, 张继红, 刘毅, 等. 不同种类浮游植物对CO2浓度升高的响应. 渔业科学进展, 2019, 40(1): 27–35]

Mackinder L, Wheeler G, Schroeder D,. Molecular mechanisms underlying calcification in coccolithophores. Geomicrobiology Journal, 2010, 27(6–7): 585–595

Meier KJS, Beaufort L, Heussner S,. The role of ocean acidification incoccolith thinning in the Mediterranean Sea. Biogeosciences Discussions, 2014(11): 2857–2869

Michaelis L, Menten ML. Die kinetik der invertinwirkung. Biochemische Zeitschrift, 1913,49: 333–369

Müller, MN Schulz KG, Riebesell U. Effects of long-term high CO2exposure on two species of coccolithophores. Biogeosciences, 2010, 7(3): 1109–1116

Orr JC, Fabry VJ, Aumont O,. Anthropogenic ocean acidification over the twenty-first century and its impact on calcifying organisms. Nature, 2005, 437(7059): 681–686

Pelletier G, Lewis E, Wallace D. CO2Sys. xls: A calculator for the CO2system in seawater for microsoft excel/VBA. Washington State Department of Ecology/Brookhaven National Laboratory, Olympia, WA/Upton, NY, USA, 2007

Raven JA, Crawfurd K. Environmental controls on coccolithophore calcification. Marine Ecology Progress Series, 2012, 470: 137–166

Raven JA. Effects on marine algae of changed seawater chemistrywith increasing atmospheric CO2. Biology and Environment- Proceedings of the Royal Irish Academy, 2011, 111(1): 1–17

Read BA, Kegel J, Klute MJ,. Pan genome of the phytoplanktonunderpins its global distribution. Nature, 2013, 499(7457): 209–213

Reinfelder JR. Carbon concentrating mechanisms in eukaryotic marine phytoplankton. Annual Review of Marine Science, 2011, 3(1): 291–315

Rickaby REM, Henderiks J, Young JN. Perturbing phytoplankton: Response and isotopic fractionation with changing carbonate chemistry in two coccolithophore species. Climate of the Past, 2010, 6(6): 771–785

Riebesell U, Tortell PD. Effects of ocean acidification on pelagic organisms and ecosystems. Ocean Acidification, 2011: 99–121

Riebesell U, Zondervan I, Rost B,. Reduced calcification of marine plankton in response to increased atmospheric CO2. Nature, 2000, 407(6802): 364–367

Rokitta SD, John U, Björn R. Ocean acidification affects redox-balance and ion-homeostasis in the life-cycle stages of. PLoS One, 2012, 7(12): e52212

Rokitta SD, Rost B. Effects of CO2and their modulation by light in the life-cycle stages of the coccolithophoreLimnology and Oceanography, 2012, 57(2): 607–618

Ross PM, Parker L, O’Connor WA,. The impact of ocean acidification on reproduction, early development and settlement of marine organisms. Water, 2011, 3(4): 1005–1030

Sciandra A, Harlay J, Lefèvre D,. Response of coccolithophoridto elevated partial pressure of CO2under nitrogen limitation. Marine Ecology Progress Series, 2003, 261: 111–122

Shi D, Xu Y, Morel FMM. Effects of the pH/pCO2control method on medium chemistry and phytoplankton growth. Biogeosciences, 2009, 6(7): 1199–1207

Sinutok S, Hill R, Doblin MA,. Warmer more acidic conditions cause decreased productivity and calcification in subtropical coral reef sediment-dwelling calcifiers. Limnology and Oceanography, 2011, 56(4): 1200–1212

Stojkovic S, Beardall J, Matear R. CO2-concentrating mechanisms in three southern hemisphere strains of. Journal of Phycology, 2013, 49(4): 670–679

Suffrian K, Schulz KG, Gutowska MA,. Cellular pH measurements inreveal pronounced membrane proton permeability. New Phytologist, 2011, 190(3): 595–608

Taylor AR, Chrachri A, Wheeler G,. A voltage-gated H+channel underlying pH homeostasis in calcifying coccolithophores. PLoS Biology, 2011, 9(6): 14–16

Trimborn S, Langer G, Rost B,. Effect of varying calcium concentrations and light intensities on calcification and photosynthesis in. Limnology and Oceanography, 2007, 52(5): 2285–2293

Turley C, Eby M, Ridgwell AJ,. The societal challenge of ocean acidification. Marine Pollution Bulletin, 2010, 60(6): 787–792

Winter A, Henderiks J, Beaufort L,. Poleward expansion of the coccolithophore. Journal of Plankton Research, 2014, 36(2): 316–325

Winter A, Siesser WG. Coccolithophores. Coccolithophores, 1994(95): 252

Xu D, Wang Y, Fan X,. Long-term experiment on physiological responses to synergetic effects of ocean acidification and photoperiod in the Antarctic sea ice algaesp. ICE-L. Environmental Science and Technology, 2014, 48(14): 7738–7746

Young JR, Poulton AJ, Tyrrell T. Morphology ofcoccoliths on the northwestern European shelf–Is there an influence of carbonate chemistry? Biogeosciences, 2014, 11(17): 4771–4782

Zondervan I, Rost B, Riebesell U. Effect of CO2concentration on the PIC/POC ratio in the coccolithophoregrown under light-limiting conditions and different daylengths. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2002, 272(1): 55–70

Effects of Ocean Acidification on Physiological Characteristics of Coccolithophores

HUANG Shujie1,2,3,4, XU Dong4, WANG Dongsheng4, ZHANG Xiansheng4, YE Naihao4①

(1. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 2. International Research Center for Marine Biosciences, Ministry of Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306; 3. Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources, Shanghai Ocean University, Ministry of Education, Shanghai 201306; 4. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao 266071)

Ocean acidification caused by increasing amounts of carbon dioxide has a great impact on marine organisms, especially calcified coccolithophores. However, culture experiments examining the response of coccolithophores to elevated CO2pa have mostly been based on investigations of a single strain and have yielded differences and even contradictory results from experiments between and even within species. Here, four strains of the coccolithophores, which contained naked and calcifying strains, were investigated simultaneously for the first time. Four carbon dioxide concentration gradients (400 µatm, 750 µatm, 1000 µatm, and 2000 µatm) were set up to systematically study the effects of ocean acidification on growth, photosynthesis, nitrogen source absorption, element composition and calcification efficiency of four coccolithophore species by batch aeration culture. The results did not show a uniform response from the different strains to elevated CO2concentrations up to 2000 µatm, and the naked strain(N-E) was seriously suppressed, which was in sharp contrast to the positive response of the other three algae to the different levels. On the other hand, photosynthetic parametersv/m, Y(II) and pigment show overall downward trend for all four strains, and calcification efficiency of C-E and C-G decrease 35.4% and 68.9% respectively, on the seventh day. In addition, the four coccolithophore strains of particulate organic nitrogen production show an increasing trend and the resulting POC/PON and PIC/POC declin. We determined that the responses of coccolithophores to ocean acidification are specific, and this variation may cause changes to biodiversity and other ecosystem processes in the ocean of the future.

Ocean acidification; Coccolithophores; Specific; Biodiversity

YE Naihao, E-mail: yenh@ysfri.ac.cn

* 国家重点研发计划“蓝色粮仓科技创新”重点专项(2018YFD0900703; 2018YFD0901503-8)、中国水产科学研究院黄海水产研究所基本科研业务费(20603022019006)、青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室渔业科技青年人才计划项目(2018-MFS-T01)和山东省自然科学基金(ZR2017MD025)共同资助 [This work was supported by the National Key R&D Program of China (2018YFD0900703, 2018YFD0901503-8), Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund, YSFRI, CAFS (20603022019006), and Youth Talent Program Supported by Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (2018-MFS-T01), and Shandong Provincial Natural Science Foundation, China (ZR2017MD025)]. 黄书杰，E-mail: huangshujie1221@163.com

叶乃好，研究员，E-mail: yenh@ysfri.ac.cn

2019-03-19,

2019-04-11

S917

A

2095-9869(2020)03-0011-14

10.19663/j.issn2095-9869.20190319003

http://www.yykxjz.cn/

黄书杰, 徐东, 王东升, 张现盛, 叶乃好. 海洋酸化对颗石藻生理特性的影响. 渔业科学进展, 2020, 41(3): 11–24

Huang SJ, Xu D, Wang DS, Zhang XS, Ye NH. Effects of ocean acidification on physiological characteristics of coccolithophores. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(3): 11–24

(编辑 冯小花)