具防病并提高植物耐旱功能的小链霉菌HS57的筛选

牛红杰 荆玉玲 郭荣君 李世东

摘要 本研究旨在尋找防治黄瓜枯萎病并提高植物抗逆能力的多功能菌株。从连作田健康黄瓜根际土中分离筛选到1株放线菌HS57。平板对峙法测定菌株HS57对尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和立枯丝核菌的抑制作用，平皿对扣共培养法测定其挥发性物质对尖孢镰刀菌的抑制作用，温室盆栽法测定其对黄瓜枯萎病的防病效果及对小麦耐旱能力的影响，结合菌株形态特征和16S rRNA基因序列分析对其进行鉴定。结果表明，菌株HS57可抑制3种病原菌生长，其中对尖孢镰刀菌的抑制率为52.4%;其挥发性物质对尖孢镰刀菌的抑制率为32.1%。浓度为107 个/mL的HS57孢子悬浮液浸种对黄瓜枯萎病的防效最好，为51.0%;小麦种子经浓度为107、108个/mL的HS57孢子悬浮液浸种，麦苗经连续7 d缺水处理后再浇水，比对照恢复得更好。初步鉴定HS57菌株为小链霉菌Streptomyces parvus，是一株非常有潜力的多功能菌株。

关键词 小链霉菌; 黄瓜枯萎病; 防病; 耐旱能力

中图分类号： S 476.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019224

Screening of Streptomyces parvus HS57 with the biocontrol function and ability to enhance the plants tolerance to water shortage stress

NIU Hongjie， JING Yuling， GUO Rongjun， LI Shidong

（Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

The purpose of this study is to find a multifunctional strain to control cucumber wilt disease and enhance the plants tolerance to unfavorable conditions. An actinomycete strain HS57 with strong antagonistic effect on Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum （Foc） was isolated from the rhizosphere soil of the healthy cucumber plants. The inhibitive activity of strain HS57 on mycelial growth of F.oxysporum， F.solani and Rhizoctonia solani was determined by using pair-culturing method. In addition， the effect of its volatiles on Foc growth was determined by using an up-down co-culturing method with the plates separately inoculated with HS57 and Foc. The efficacy of strain HS57 in suppressing cucumber wilt disease and its ability to improve the wheat tolerance to water shortage stress were tested in the greenhouse by seed soaking with different concentrations of HS57 spores. Strain HS57 was identified based on the morphological characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis. The results showed that strain HS57 inhibited the mycelial growth of F.oxysporum， F.solani and R.solani. Among the three fungi， F.oxysporum was suppressed with an inhibitive rate of 52.4%. Moreover， the volatiles produced by strain HS57 also had a good ability to inhibit F.oxysporum growth with an inhibitory rate of 32.1%. In the greenhouse assay， strain HS57 showed good control efficacy （51.0%） against cucumber fusarium wilt at the concentration of 107 spores/mL. Seed treatments with 107 and 108spores/mL of strain HS57 also enhanced the wheat tolerance to water shortage stress， demonstrated by better recovery of the seedlings than the control after 7 d-non-irrigation and re-irrigation. Strain HS57 was identified as Streptomyces parvus based on its morphological characteristics and its 16S rRNA gene sequence analysis. As a multifunctional strain， HS57 showed a great potential for practical application.

Key words

Streptomyces parvus; cucumber fusarium wilt; disease control; water shortage tolerance

黄瓜枯萎病是由尖孢镰刀菌黄瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum （Foc）引起的典型土传病害，在我国及全球黄瓜种植区普遍发生[1]。我国黄瓜枯萎病常年发病率为10%～30%，严重时可达80%～90%，甚至导致绝产，该病已成为制约我国黄瓜生产的重要因素之一[2]。黄瓜枯萎病在黄瓜整个生育期内均可发生，尤以开花结果期最为严重，防治较为困难。目前生产上主要以预防为主，选用抗病品种，采用轮作或嫁接等栽培管理措施，并配合使用化学农药等方法，达到综合防治该病害的目的[3]。化学农药长期使用会导致抗药性产生、药物残留、污染环境等问题，而且针对维管束类病害目前并没有特别有效的化学农药。嫁接在一定程度上可控制病害的发生，但会造成黄瓜口感的下降;抗病品种防治黄瓜枯萎病虽经济有效[4]，但长期种植会导致枯萎病菌致病力上升[5]，可能导致抗性丢失，重新选育新的抗病品种所需时间较长，致使抗性品种在黄瓜枯萎病的防治上存在一定局限性[6];而生物防治安全友好，无残留、无污染、无毒害，更加符合现代农业可持续发展的思路。

国内外学者开展了利用生防微生物防治黄瓜枯萎病的研究。目前已经报道具有生防作用的生防微生物主要有木霉Trichoderma spp.、芽胞杆菌Bacillus spp.、假单胞菌Pseudomonas spp.和链霉菌Streptomyces spp.。Chen等[7]、Cao等[8]研究发现枯草芽胞杆菌B579、SQR9对病原菌有抑制作用。刘爱荣等[9]研究表明，哈茨木霉对Foc的抑制率可达66.7%～85.8%;108 个/mL的孢子悬浮液在田间试验防效可达50%。Li等[10]鉴定了3株对尖孢镰刀菌有抑制作用的木霉，分别为T.asperellum 525，T.harzianum 610和T.pseudokoningii 886，盆栽试验表明3株木霉对黄瓜枯萎病的防效均超过78%，还能提高黄瓜品质和产量。路丹丹等[11]从龟裂链霉菌M527发酵液中分离到活性化合物龟裂杀菌素;盆栽试验表明，施用17.56 mg/L 的龜裂杀菌素溶液14 d 和 21 d 对黄瓜枯萎病的防治效果分别为78.3%和70.6%。上述研究取得了一定的效果，而生产中常遇到干旱或水涝等恶劣天气，严重影响作物产量，获得可提高作物防病能力以及应对短时间旱涝胁迫能力的多功能生防菌株，对实际生产具有重要的意义。

本研究从河北廊坊采集了连作黄瓜田健康黄瓜根际土，并进行了拮抗菌的分离，旨在发现可更好定殖于连作土壤的生防菌。经分离筛选获得一株对黄瓜枯萎病菌Foc有较好抑制作用的放线菌HS57，经鉴定为小链霉菌S.parvus。平板对峙、平板对扣共培养显示菌株HS57能抑制尖孢镰刀菌菌丝的生长，该菌株不仅对黄瓜枯萎病具有较好的防病效果，还可以增强小麦耐干旱能力，是一株具有防病抗旱功能的多功能菌株，具有很大的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试作物品种

黄瓜枯萎病感病品种‘中农6号，购于中蔬种业科技（北京）有限公司;小麦无抗病基因品种‘铭贤169，由中国农业科学院植物保护研究所小麦病害课题组惠赠。

1.1.2 供试菌株

菌株HS57分离自中国农业科学院植物保护研究所廊坊中试基地的健康黄瓜根际土，保存于本实验室;尖孢镰刀菌黄瓜专化型F.oxysporum f.sp. cucumerinum、立枯丝核菌Rhizoctonia solani、茄病镰刀菌F.solani，均由本实验室保存;青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum由中国农业科学院植物保护研究所冯洁老师惠赠;果胶杆菌Pectobacterium spp.由中国农业大学张力群老师惠赠。

1.1.3 供试培养基

固体培养基：高氏一号培养基[12]、HV培养基[13]、NA培养基[14]、PDA培养基、WA-N培养基[15]、ISP2培养基[16]、刚果红培养基[17]。

液体培养基：Armstrong液体培养基[18]。

种子液：GYMM[19]、SNGY[20]、PDB。

发酵液：MA1[20]、MA2[21]、M1：可溶性淀粉15 g、牛肉膏2 g、 葡萄糖1 g、酵母粉3 g、蛋白胨2 g、CaCO3 3 g、蒸馏水 1 000 mL， pH 7.2。

1.1.4 供试土壤

采集自中国农业科学院植物保护研究所温室外菜地，过2 mm网筛，备用。

1.2 方法

1.2.1 菌株HS57的分离

2017年6月，从中国农业科学院植物保护研究所廊坊基地连作数年的健康黄瓜根际采集土样，带回实验室保存于4℃备用。土样过2 mm的网筛，于避光处自然风干5～9 d，取风干后土样10 g于装有90 mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，置于15℃、180 r/min摇床中振荡45 min，然后进行系列梯度稀释，吸取100 μL均匀涂布于添加有50 mg/L放线菌酮和20 mg/L的萘啶酮酸的高氏一号和HV培养基平板上，28℃培养箱中培养。3 d后挑取颜色、形状外观不同的单菌落，多次划线纯化。

1.2.2 菌株HS57拮抗性测定

对病原真菌的拮抗性测定：平板对峙法[22]，先将直径8 mm的不同放线菌菌块分别接种在距培养皿中心3 cm处，28℃培养24 h后，将病原菌接种于PDA平板中央。对病原细菌的拮抗性测定：先将菌体浓度为108  cfu/mL的病原细菌涂布于NA平板，立即将直径为8 mm的放线菌菌块分别接种在距培养皿中心3 cm处，试验重复3次，置于28℃培养箱培养3～7 d，观察抑菌效果。

2.5 菌株HS57对黄瓜枯萎病的防治效果

试验结果（表2）表明，不同浓度放线菌HS57孢子液浸种处理的黄瓜种子出苗率與对照组无差异，病原菌浸种处理种子出苗率低于对照。各处理间病情指数差异显著，其中HS57孢子液浓度为107个/mL时发病率最低，病情指数最小，防治效果最好，可达51.0%。

CK1：黄瓜种子用无菌水浸泡30 min;CK2：黄瓜种子在105 个/mL的尖孢镰刀菌黄瓜专化型 （Foc） 孢子液中浸泡30 min;T1、T2、T3：黄瓜种子在浓度为105 个/mL的Foc孢子液和浓度分别为106、107和108个/mL的菌株HS57孢子液的混合液中浸泡30 min。

The data in the table are the means±standard deviation. The different letters in the same column indicate that the difference was significant at P<0.05 by the Duncans test.

CK1： Cucumber seeds are soaked in sterile water for 30 min; CK2： Cucumber seeds are soaked in spore suspension of the pathogen Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum （105 spores/mL） for 30 min; T1， T2， T3： Cucumber seeds are soaked in the mixture of Foc spore suspension （105 spores/mL） and strain HS57 spore suspension at the concentration of 106， 107 and 108 spores/mL， respectively.

2.6 放线菌HS57对小麦耐旱能力的影响

经不同浓度HS57孢子液处理的小麦，在苗期缺水处理后再浇水，麦苗的恢复能力不同。107 个/mL和108 个/mL浸种处理比106 个/mL处理和清水对照更耐干旱，表现为干旱处理后萎蔫干黄的叶片部分恢复变绿，如图5A、5B所示，表明该菌株处理后可使小麦更耐旱。

2.7 菌株HS57的初步鉴定

菌株HS57在高氏一号培养基上生长形态如图6 a。光学显微镜观察，菌株HS57的气生菌丝多分枝，无横隔膜，气生菌丝顶端分化呈松散螺旋状孢子丝，孢子呈短杆状（图6 b、c）。采用16S rRNA基因扩增引物从菌株HS57的基因组DNA中扩增到一条约1 500 bp左右的条带，序列提交到GenBank（登录号：MG551267）;与NCBI数据库中相似序列同源比对，发现其16S rRNA基因序列与小链霉菌Streptomyces parvus的同源性为99.86%。采用邻接法（neighbor-joining method， NJ）构建系统发育

进化树（图7），菌株HS57与S.parvus聚在同一分支。根据形态特征结合16S rRNA基因序列分析，将放线菌HS57初步鉴定为S.parvus。

3 讨论

放线菌能产生丰富的次级代谢产物，作为重要的生防资源，具有广阔的应用前景。国内外利用放线菌防治黄瓜枯萎病的研究已有报道。张璐等[26]从黄瓜根际土壤筛选的放线菌SG-126对黄瓜枯萎病的防治效果为42.86%，能显著促进黄瓜的生长发育，同时提高黄瓜叶片保护酶活性和叶绿素含量，降低电解质渗透率;梁银等[27]从土壤中分离出的拮抗链霉菌对黄瓜枯萎病的防效为51.58%。但是目前这些菌株都尚未商品化。其中重要原因是生防菌应用于田间可能不适应田间土壤条件，特别是连作田，因此挖掘更多的生防菌资源是一项重要的任务。为此，本研究开展了黄瓜连作田中拮抗菌的分离筛选工作，并获得1株对黄瓜枯萎病具有良好拮抗效果的S.parvus菌株HS57，温室防效可达51.0%。虽然前人对小链霉菌曾有一些研究，但大部分研究集中在对植物病毒[28]、医学耐药菌株[29]、植物细菌病害[30]的抑制作用以及代谢产物[31]方面，有关小链霉菌对植物真菌病害的研究尚未见报道。菌株HS57的获得丰富了黄瓜枯萎病的生防菌资源。

在筛选生防菌时，除考虑菌株的拮抗效果外，生防菌在土壤中的快速繁殖和定殖是其发挥生防潜力的重要前提条件，因此筛选生防菌时需考虑菌株的生长速度。菌株HS57在常用的高氏一号、PDA、ISP2等放线菌培养基上均可快速生长，说明该菌株生长迅速，具备在土壤中快速占位的潜力。此外，生防菌的工业化生产性能也是需要我们注意的一个因素，很多生防效果非常好的菌株常因规模化生产存在一定难度而得不到推广和应用。菌株HS57在文献报道的放线菌发酵培养基MA1、MA2中不产孢或产孢很慢。经筛选，我们获得了发酵培养基M1，菌株HS57在M1中培养3 d即可大量产孢，比一般的放线菌的发酵周期短[32]，而且经过进一步优化后，48 h即可完成发酵（已申请专利，申请号：201810017582.2），具有可规模化生产的潜力，有利于该菌株的商品化。除上述特点外，菌株HS57还具有提高植物耐旱能力和降解纤维素的能力，具有应用于有机肥或与其他载体混和使用的潜力。

综上所述，小链霉菌HS57是一株非常有潜力的多功能菌株，具有很大的应用潜能。后续将开展生防菌在植物根际土壤中的定殖及其防病机理研究，以便更好地促进小链霉菌HS57的应用。

参考文献

[1] ZHOU Xingang， WU Fengzhi. Dynamics of the diversity of fungal and Fusarium communities during continuous cropping of cucumber in the greenhouse [J]. FEMS Microbiology Ecology， 2012， 80（2）： 469478.

[2] 郭晋云， 胡晓峰， 李勇， 等. 黄瓜枯萎病对黄瓜光合和水分生理特性的影响[J]. 南京农业大学学报， 2011， 34（1）： 7983.

[3] 林璐璐. 黄瓜枯萎病的研究[J]. 农业灾害研究， 2011， 1（2）： 2329.

[4] 徐彦刚， 贺振， 李瑞， 等. 黄瓜枯萎病研究进展[J]. 中国瓜菜， 2018， 31（6）： 16.

[5] HUANG Xiaoqing， SUN Manhong， LU Xiaohong， et al. Serial passage through resistant and susceptible cucumber cultivars affects the virulence of Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum [J/OL]. Microbiology Open， 2019， 8（2）： e00641. DOI：10.1002/mb03.641.

[6] 毛爱军， 张峰， 张丽蓉， 等. 不同黄瓜材料对枯萎病的抗性评价[J].华北农学报，2008，23（2）：214216.

[7] CHEN Fang， WANG Min， ZHENG Yu， et al. Quantitative changes of plant defense enzymes and phytohormone in biocontrol of cucumber Fusarium wilt by Bacillus subtilis B579 [J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology， 2010， 26（4）： 675684.

[8] CAO Yun， ZHANG Zhenhua， LING Ning， et al. Bacillus subtilis SQR 9 can control Fusarium wilt in cucumber by colonizing plant roots [J]. Biology and Fertility of Soils， 2011， 47（5）： 495506.

[9] 刘爱荣， 陈双臣， 陈凯， 等. 哈茨木霉对黄瓜尖孢镰刀菌的抑制作用和抗性相关基因表达[J]. 植物保护学报， 2010， 37（3）： 249254.

[10]LI Mei， MA Guangshu， LIAN Hua， et al. The effects of Trichoderma on preventing cucumber fusarium wilt and regulating cucumber physiology [J]. Journal of Integrative Agriculture， 2019， 18（3）： 607617.

[11]路丹丹， 赵艳芳， 马正， 等. 龟裂链霉菌M527抗真菌物质的分离鉴定及其在黄瓜枯萎病防治中的应用[J]. 中国生物防治学报， 2016， 32（6）： 783787.

[12]赵珂. 攀西地区药用植物内生及根际放线菌的多样性与抗菌活性研究[D]. 雅安：四川农业大学， 2010.

[13]夏广欣. 土壤放线菌的筛选、鉴定及其发酵产物的活性研究[D]. 哈尔滨：东北农业大学， 2012.

[14]韩如月， 李睿瑞， 杨帆， 等. 一株水稻根内生拮抗细菌SM13的分离及鉴定[J]. 微生物学通报， 2019， 46（5）： 10301040.

[15]GARBEVA P， DE BOER W. Inter-specific interactions between carbon-limited soil bacteria affect behavior and gene expression [J]. Microbiology Ecology， 2009， 58（1）： 3646.

[16]SHIRLING E B， GOTTLIEB D. Methods for characterization of Streptomyces species [J]. International Journal of Systematic Bacteriology， 1966， 16（3）： 313340.

[17]廖敏. 四川阿壩地区药用植物内生拮抗放线菌的筛选及其防病促生机制研究[D]. 雅安：四川农业大学， 2016.

[18]黄晓庆. 连作土壤中黄瓜枯萎病菌的致病力变化规律及强、弱致病力菌株的转录组分析[D]. 北京：中国农业科学院， 2018.

[19]赵韵宇， 孙伟， 彭崇胜， 等. 海洋放线菌Streptomyces variabilis strain 6-1次级代谢产物的研究[J]. 现代生物医学进展， 2012， 12（26）：50015004.

[20]刘亮山， 林茂松， 鄢小宁， 等. 生防链霉菌JH108-2的发酵培养基优化[J]. 植物病理学报， 2006， 36（3）： 259266.

[21]黄隽， 林甲檀， 周敏， 等. 吸水链霉菌HS023 milF基因敲除构建产5-酮米尔贝霉素基因工程菌[J]. 微生物学报， 2015， 55（1）：107113.

[22]金鑫. 稻瘟病生防菌Af1、Af4的初步研究[D]. 武汉：华中农业大学， 2010.

[23]高毓晗. 产surfactin枯草芽胞杆菌168重组菌株构建及其对黄瓜枯萎病的控制作用[D]. 北京：中国农业科学院， 2015.

[24]韩秀芳. 土壤放线菌分离菌株的分类鉴定与拮抗性筛选[D]. 北京：北京理工大学， 2015.

[25]WEISBURG W G， BARNS S M， PELLETIER D A， et al. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study [J]. Journal of Bacteriology， 1991， 173（2）： 697703.

[26]张璐， 杜秉海， 魏珉， 等. 黄瓜枯萎病拮抗菌的生防效果及其对植株生长代谢的影响[J]. 山东农业科学， 2007（4）： 8992.

[27]梁银， 张谷月， 王辰， 等. 一株拮抗放线菌的鉴定及其对黄瓜枯萎病的生防效应研究[J]. 土壤学报， 2013， 50（4）： 810817.

[28]田兆丰， 刘伟成， 刘霆， 等. 小链霉菌Yn168发酵产物抗植物病毒活性的研究[J]. 中国生物防治学报， 2011， 27（4）： 569572.

[29]康银花， 王旻. 抗MRSA小链霉菌NIM521发酵工艺的优化[J]. 药物生物技术， 2008， 15（3）： 208211.

[30]孙建龙， 于基成， 刘秋， 等. 响应面法优化小链霉菌产抗生素发酵条件[J]. 沈阳农业大学学报， 2012， 43（2）： 168172.

[31]田兆丰， 刘霆， 吴慧玲， 等. 小链霉菌Yn168抗病毒活性组分的分离及其稳定性研究[J]. 华北农学报， 2015， 30（2）：124127.

[32]路春玲， 王杰， 王立刚， 等. 产蓝色色素放线菌的分离鉴定及发酵工艺条件优化[J]. 药物生物技术， 2014， 21（6）： 550553.

（责任编辑：田 喆）

收稿日期： 20190429   修订日期： 20190707

基金项目：国家重点研发计划（2016YFD0201000）;中央級公益性科研院所基本科研业务费专项资金（S2018XM10）;内蒙古自治区科技重大专项（zdzx2018009）

致  谢： 参加本试验部分工作的还有江代礼、谭翰杰、张能和纪烨斌等同学，特此一并致谢。

通信作者E-mail：guorj20150620@126.com

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