超高效液相色谱-串联质谱检测鸡蛋、鸡肉和猪肉中酰胺醇类药物残留

陈涛，倪建秀，陈桂芳，李文杰

(南京市农产品质量检测院，江苏 南京 210036)

氯霉素(chloramphenicol,CAP)、甲砜霉素(thiamphenicol,TAP)、氟苯尼考(florfenicol,FF)均属于酰胺醇类药物，具有广谱抗菌性，对革兰阳性和革兰阴性菌都具有抑制作用，因此在畜禽养殖中常被用于预防和治疗细菌感染[1-3]。然而，研究发现氯霉素对人类的造血系统有明显的毒性作用，可引起再生障碍性贫血，甲砜霉素则会抑制红细胞、白细胞和血小板的生成，而氟苯尼考具有胚胎毒性[4-5]。因此为了避免此类药物在动物源性食品中的残留给人类健康造成危害，在世界各国，该类药物的使用都受到严格的限制。欧盟关于兽药残留的(EU)No 37/2010号法规和我国农业部235号公告都规定氯霉素为禁用药物，甲砜霉素的最高残留限量为50 μg/kg(蛋鸡产蛋期为禁用)，氟苯尼考在鸡肉中的最高残留限量为100 μg/kg，在猪肉中为300 μg/kg(蛋鸡产蛋期为禁用)。氟苯尼考胺(florfenicol amine,FFA)是氟苯尼考在动物体内代谢的主要产物[6]，因此农业部235号公告将其作为标志残留物计算氟苯尼考残留量，而欧盟(EU)No 37/2010号法规中氟苯尼考残留量是以氟苯尼考胺和氟苯尼考残留总量计。

目前该类药物的检测方法主要有液相色谱法[7]、液相色谱-串联质谱法[8-10]、气相色谱-串联质谱法[11]、毛细管电泳法[12]、酶联免疫法等[13]，其中液相色谱-串联质谱法因其具有较高的灵敏度和准确性，得到广泛应用。Xie等[14]采用乙酸乙酯∶乙腈∶氨水(49∶49∶2，V/V)混合溶液提取、正己烷去脂后进行液相色谱-串联质谱分析，对鸡蛋中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺进行定量检测，取得良好的回收率和精密度结果。Barreto等[9]选择乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)作为提取溶剂，对禽肉、猪肉、牛肉和鱼肉中的4种酰胺醇类药物进行定量检测，提取物经正己烷去脂后进行液相色谱-串联质谱分析，结果显示在牛肉基质中4种化合物的回收率范围为82%～108%。

酰胺醇类药物作为一类廉价、高效的抗生素在畜禽养殖中有着广泛的使用，但不规范、不合理甚至非法用药的现象时有发生，因此需要建立一种可同时检测多种畜禽产品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的准确、稳定的定量检测方法，对此类药物在畜禽产品中的残留进行监控。目前国内畜禽产品中酰胺醇类药物残留的检测标准大多只检测氟苯尼考原型而未检测其代谢产物，且同时检测禽蛋、禽肉和猪肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺残留量的超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)的报道较少。曾勇等[15]采用液相色谱串联质谱法测定禽蛋和禽肉中酰胺醇类药物残留，未包括猪肉基质。本文使用经过优化的提取溶剂和固相萃取(SPE)步骤，进行超高效液相色谱-串联质谱分析，最终方法检出限可达0.1 μg/kg，为同时检测鸡蛋、鸡肉和猪肉中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考及氟苯尼考胺残留建立了一种灵敏度高、稳定性好的超高效液相色谱-串联质谱检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考对照品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；氟苯尼考胺对照品购自德国Witega公司；氘代氯霉素(氯霉素-d5)、氘代氟苯尼考(氟苯尼考-d3)对照品购自加拿大TRC公司；乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、丙酮为色谱纯，购自美国TEDIA公司；乙酸铵、甲酸、乙酸为色谱纯，购自美国Sigma-aldrich公司；试验用水为Millipore系统所制超纯水。

精密称取上述标准品，用甲醇各自配制成100 μg/mL标准储备液，然后精密量取氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺标准储备液适宜体积，用甲醇配制成1.0 μg/mL的混合标准工作液。同时精密量取氯霉素-d5和氟苯尼考-d3内标标准储备液适宜体积，用甲醇配制成1.0 μg/mL的混合内标标准工作液。标准溶液均置于-20 ℃保存。

1.2 样品处理

提取：称取2.00 g(精确至0.01 g)试样于 50 mL聚丙烯离心管中，加入1.0 μg/mL混合内标标准工作液10 μL,再加入乙腈∶氨水(98∶2，V/V)溶液10 mL，于涡旋混合器上混合1 mim后振荡20 min,以4 ℃，10 000 r/min,离心5 mim,取上清液，再向沉淀中加入10 mL乙酸乙酯重复提取1次,合并2次提取上清液，40 ℃水浴中氮吹至近干，然后用5 mL丙酮∶正己烷(1∶9，V/V)溶液复溶待用。

净化：将复溶后的提取液全部转移至经5 mL丙酮∶正己烷(1∶9，V/V)溶液活化的CNW Si SPE柱中，挤干后用5 mL丙酮∶正己烷(6∶4，V/V)溶液洗脱，洗脱液在40 ℃水浴中氮吹至近干。用1 mL乙腈∶水(3∶7，V/V)溶液溶解，再加入2 mL正己烷，4 000 r/min,离心10 mim,取下层过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱测定。

1.3 仪器条件

1.3.1 超高效液相色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18 (100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，前端连接ACQUITY UPLC CSH保护柱(5 mm×2.1 mm，1.7 μm)。流动相A为2 mmol/L乙酸铵水溶液，流动相B为mmol/L乙酸铵乙腈溶液。梯度洗脱：0.2～6 min,5% B～60% B, 6～7 min, 60% B～95% B, 7～8 min, 维持95% B, 8～8.1 min, 95% B～5% B, 8.1～9.5 min,维持5% B,流速0.3 mL/min,进样量5 μL，流路在1～6 min之间进入质谱，在1 min之前和6 min之后切向废液，柱温为40 ℃。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源ESI；0～2.5 min,进行正离子模式扫描(氟苯尼考胺)，2.5～9.5 min，进行负离子模式扫描(氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5、氟苯尼考-d3)，雾化气压力为414 kPa,气帘气压力为207 kPa,辅助加热气压力为345 kPa，碰撞气设置为Medium,以上4种气体均为氮气，离子源温度为600 ℃，正离子化电压为4 500 V，负离子化电压为-4 500 V，多反应监测(MRM)采集模式，优化后的4种化合物及2种内标物的检测离子、对应质谱参数见表1。

表1 4种化合物及2种内标物的检测离子、对应质谱参数

名称母离子/(m·z-1)子离子/(m·z-1)去簇电压/V碰撞电压/eV氟苯尼考胺248.0230.1*12015130.012028氟苯尼考356.0336.0*-100-14185.1-100-25氯霉素321.1152.1*-85-23256.9-85-15甲砜霉素353.9289.9*-85-16184.9-85-26氟苯尼考-d3359.0188.0*-130-25氯霉素-d5326.0157.0*-120-23

注：*表示定量子离子。

2 结果与分析

2.1 检测方法优化

2.1.1 质谱条件优化

采用针泵直接进样方式，对50 ng/mL的氟苯尼考胺标准溶液进行正离子模式下母离子全扫描，确定其分子离子峰，同样方式对50 ng/mL的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5、氟苯尼考-d3标准溶液进行负离子模式下母离子全扫描，确定其分子离子峰，然后以这些分子离子作为母离子进行子离子全扫描，选择其中响应水平较高且干扰较小的2个子离子分别作为定量和定性离子，最后优化其去簇电压和碰撞电压等质谱参数，结果详见表1。

2.1.2 液相色谱条件优化

尝试选择含不同浓度乙酸铵的水和乙腈溶液作为流动相，最终发现乙酸铵为2 mmol/L时，氟苯尼考胺可以在C18柱上获得足够保留时间，各化合物的峰形和响应强度也较好，同时在添加基质后，目标物出峰处没有明显杂峰干扰(见图1～3)，最终选择含2 mmol/L乙酸铵的水和乙腈溶液作为流动相。

2.1.3 前处理条件优化

选择乙腈、乙酸乙酯、乙腈∶氨水(98∶2，V/V)、乙酸乙酯∶氨水(98∶2，V/V)、乙腈∶乙酸乙酯∶氨水(49∶49 ∶2，V/V)作为提取溶剂，并比较了在不同提取溶剂间进行组合提取后的回收率，结果显示乙腈∶氨水(98∶2，V/V)提取1次后再使用乙酸乙酯提取1次，4种化合物的添加回收率整体较好，结果详见图4～6。

在净化环节，本文比较了BoundElut-C18、Oasis MCX、Oasis HLB 和CNW Si 4种SPE柱对鸡蛋、鸡肉和猪肉3种基质的净化效果，最终选择使用CNW Si小柱，其去除干扰杂质效果较好，4种化合物整体回收率较高。

2.2 线性和灵敏度

精密量取酰胺醇类标准工作液适量，用空白基质提取液稀释成含有各化合物浓度分别为0.2、1.0、5、10、20、50、100 ng/mL的混合标准工作液(氟苯尼考-d3、氯霉素-d5内标浓度为10 ng/mL)，依次进样，将测得的峰面积比值与对应浓度比值拟合，绘制标准曲线，结果表明在0.2～100 ng/mL范围内，各化合物在不同基质中标准曲线的线性良好，相关系数均大于0.99，结果见表2。

向空白试样中逐级添加4种化合物，以获得的各目标化合物的定量离子峰信噪比≥3时的最低添加浓度为该化合物的方法检测限，以信噪比≥10时的最低添加浓度为该化合物的方法定量限。结果表明，在鸡蛋、鸡肉和猪肉中，酰胺醇类4种化合物的检测限为0.1 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。

2.3 回收率和精密度

向空白试样中添加0.5、1.0、2.0 μg/kg的3个不同浓度的混合标准工作液，每个浓度6个平行，按照1.2方法进行添加回收试验，重复进行3次，空白基质样品和空白基质添加样品色谱图见图7及图1-3。结果显示，本方法在0.5～2.0 μg/kg添加范围内，回收率范围为70.6%～112.3%，批内相对标准偏差为1.5%～12.7%，批间相对标准偏差为3.2%～14.5%，结果见表3。

A. 空白鸡蛋基质中添加2.0 μg/kg的4种化合物和5.0 μg/kg的2种内标物总离子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

图1 空白鸡蛋基质中添加酰胺醇类药物色谱

A.空白鸡肉基质中添加2.0 μg/kg的4种化合物和5.0 μg/kg的2种内标物总离子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

图2 空白鸡肉基质中添加酰胺醇类药物色谱

A.空白猪肉基质中添加2.0 μg/kg的4种化合物和5.0 μg/kg的2种内标物总离子流；B.氟苯尼考胺；C.甲砜霉素；D.氟苯尼考；E.氯霉素；F.氟苯尼考-d3；G.氯霉素-d5

图3 空白猪肉基质中添加酰胺醇类药物色谱

图4 鸡蛋中4种化合物不同提取条件下回收率

图5 鸡肉中4种化合物不同提取条件下回收率

图6 猪肉中4种化合物不同提取条件下回收率

2.4 基质效应

向空白试样提取液中添加适量混合标准工作液制成5 μg/kg的基质加标溶液，与同浓度溶剂加标溶液进行比较，设置3个平行，每个平行重复进样2次，记录目标化合物峰面积。试验结果表明在不同基质中氟苯尼考胺等4种化合物和氟苯尼考-d3等2种内标物都表现出一定程度的基质效应，其中氟苯尼考胺和甲砜霉素在3种基质中表现出的基质效应较弱，而氟苯尼考和氯霉素在3种基质中则有明显的基质增强效应，同时作为内标物的氟苯尼考-d3和氯霉素-d5除在鸡蛋中基质效应不显著外，在另外2种基质中则有明显基质增强效应存在,具体结果见表4。

2.5 实测样品

对从南京地区部分养殖场、屠宰场抽取的鸡蛋、鸡肉和猪肉样品各10份进行检测，并同时由质控人员向3种空白基质中随机添加4种化合物进行盲样添加试验，最终30份样品中未检出氟苯尼考等4种药物， 1份鸡肉盲样中检出氯霉素0.48 μg/kg(添加量为0.5 μg/kg)，1份鸡蛋盲样中检出氟苯尼考1.56 μg/kg(添加量为1.5 μg/kg)，盲样检测回收率与2.3添加回收试验结果相符合，说明该方法适用于鸡蛋、鸡肉和猪肉中酰胺醇类药物检测。

表2 空白基质匹配标准曲线方程、线性范围及相关系数

空白基质化合物名称标准曲线方程线性范围/(μg∙L-1)相关系数/r鸡蛋氟苯尼考胺y=0.341 05x+0.003 110.2～1000.995 5氟苯尼考y=0.837 18x+0.004 820.2～1000.995 8氯霉素y=0.745 92x+0.004 800.2～1000.998 7甲砜霉素y=0.219 81x+0.000 170.2～1000.996 8鸡肉氟苯尼考胺y=0.396 35x+0.016 720.2～1000.992 9氟苯尼考y=1.166 08x+0.002 290.2～1000.996 5氯霉素y=0.776 11x+0.001 080.2～1000.997 9甲砜霉素y=0.175 74x+0.011 390.2～1000.995 2猪肉氟苯尼考胺y=0.480 42x+0.002 730.2～1000.996 4氟苯尼考y=0.877 19x+0.005 610.2～1000.995 7氯霉素y=0.817 61x+0.004 730.2～1000.996 7甲砜霉素y=0.182 17x+0.001 280.2～1000.996 6

表3 空白基质中添加4种化合物回收率及精密度

空白基质化合物名称添加浓度/(μg∙kg-1)回收率/%批内RSD(n=6)/%批间RSD(n=3)/%氟苯尼考胺0.570.69.89.81.072.88.57.92.073.46.35.2氟苯尼考0.598.712.76.81.0107.27.110.4鸡蛋2.0101.52.68.9氯霉素0.5108.54.312.41.0105.69.27.62.0110.411.311.5甲砜霉素0.574.51.510.91.078.52.74.82.083.91.83.6氟苯尼考胺0.575.45.36.41.079.27.211.22.076.68.58.7氟苯尼考0.5105.73.35.61.0112.33.64.9鸡肉2.0109.64.03.2氯霉素0.5108.33.912.61.096.75.37.52.098.94.14.7甲砜霉素0.594.29.213.11.095.35.310.42.094.76.46.9氟苯尼考胺0.580.57.94.71.086.78.810.82.084.910.67.6氟苯尼考0.5103.15.33.31.0107.53.44.8猪肉2.0108.46.24.5氯霉素0.592.69.86.11.0105.45.712.82.0110.72.511.3甲砜霉素0.580.68.714.51.085.85.210.32.087.16.68.4

表4 不同基质中4种化合物及2种内标物基质效应

化合物名称鸡蛋鸡肉猪肉氟苯尼考胺1.041.031.04氟苯尼考1.301.521.51甲砜霉素1.061.091.03氯霉素1.251.811.75氟苯尼考-d30.941.531.60氯霉素-d51.111.281.45

3 讨论

氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、氯霉素-d5和氟苯尼考-d3的化学结构中含有卤素原子和羟基基团，具有高电负性，在质谱负离子扫描模式下获得的灵敏度较高，氟苯尼考胺的化学结构中含有氨基基团，在正离子模式下灵敏度较高[14]。因此在一次进样中要同时进行正、负两种离子模式的质谱扫描，此时流动相的选择对不同目标物的峰形和响应强度有着重要影响。在流动相中添加甲酸或乙酸，可以提高正离子模式扫描下的氟苯尼考胺的响应强度，改善其峰形，但是对采用负离子模式扫描的其他5种化合物则会产生离子抑制效应[16]。选择不添加任何物质的水和乙腈作为流动相，可以在正、负两种离子扫描模式下获得较好的响应强度，但此时极性相对较强的氟苯尼考胺在C18柱上保留则会较弱，系统死体积内就会被洗脱下来。本文最终选择含2 mmol/L乙酸铵的水和乙腈溶液作为流动相，使各化合物能够获得良好色谱分离和响应强度。

乙腈或乙酸乙酯对氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率较高[14-19]。但由于氟苯尼考胺是一种弱碱性物质，碱性环境中会更利于其在液液萃取中分配于有机相中，因此在选择提取溶剂时，需要考虑性质不同的所有目标化合物的提取效率。本文最终选择乙腈∶氨水(98∶2，V/V)提取1次后再使用乙酸乙酯提取1次，4种化合物的添加回收率整体较好。但乙酸乙酯作为提取溶剂，其对包括脂肪在内的非极性化合物有较高的选择提取性，因此需要增加正己烷去脂的步骤，可以更好的去除磷脂等脂类共提取物，进一步降低基质干扰。同时加入正己烷后的复溶样品应避免剧烈振荡，否则易产生乳化现象，造成目标化合物的损失，影响回收率。

A.鸡蛋；B.鸡肉；C.猪肉

图7 空白基质样品总离子流色谱

基质效应(matrix effect，ME)=基质加标溶液峰面积/溶剂加标溶液峰面积，若比值大于1，说明存在基质增强效应；若小于1，则说明存在基质抑制效应；若等于1，表明不存在基质效应。基质效应对目标物定量准确性的影响可通过内标法进行一定程度的校正，同时选择基质匹配的标准曲线，有助于提高定量检测的准确性。

本文建立了鸡蛋、鸡肉和猪肉中酰胺醇类药物及其代谢物残留的UPLC-MS/MS检测方法，通过对色谱、质谱条件和样品前处理方法的优化改进，使该方法具有较高灵敏度，良好稳定性，能满足同时检测畜禽产品中多种酰胺醇类药物残留的分析要求，可用于鸡蛋、鸡肉和猪肉中酰胺醇类药物检测，为制定相关检测技术标准提供了技术参考。