白酒酿造中杂醇油调控技术的研究进展

张敏倩，刘功良*，费永涛，白卫东，艾连中，俞剑燊

（1.仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东广州 510225；2.上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093；3.上海金枫酒业股份有限公司，上海 200120）

白酒的香气特征和口感是由酒体中的醇类、酯类和酸类等物质所决定。其中醇类中的杂醇油在适量的情况下会使酒体更为和谐，但杂醇油含量过高不仅会破坏酒体风格，还会引起饮后“上头”等不适现象。杂醇油的含量对白酒风味的影响至关重要。

目前，杂醇油的形成机制可归结为降解代谢机制和合成代谢机制，但杂醇油在白酒中的代谢机制仍未得到系统阐述，调控杂醇油代谢的方法可分为两大类：酿造工艺改进；菌种选育及代谢调控。

因此，本文结合杂醇油的形成机理，对历年来研究学者从白酒生产中的各阶段对杂醇油的调控进行归类和总结，为白酒中杂醇油的有效控制提供新思路。

1 杂醇油的形成机制

杂醇油又称高级醇，是指3个碳原子以上的一元醇类。正丙醇、正丁醇、异丁醇、异戊醇、活性戊醇、β-苯乙醇、辛醇、色醇和酪醇是白酒中的主要杂醇油[1-3]。研究表明，酵母杂醇油的代谢机制主要有降解代谢机制和合成代谢机制。

1.1 降解代谢机制（Ehrlich代谢机制）

Ehrlich代谢机制如下：

图1 Ehrlich代谢机制Fig.1 Metabolic mechanism of Ehrlich

在酵母酒精发酵过程中，氨基酸在线粒体中受胞质支链氨基酸转移酶（branched-chain amino acid transferases，BCAATases）的作用将氨基转移到相应的α-酮酸上；α-酮酸经特定的酮酸脱羧酶催化后，脱羧形成相应的醛[4]；醛再经醇脱氢酶作用进一步还原为相应的高级醇[5]。研究表明，异丁醇、异戊醇、活性戊醇的降解产物分别是缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸，因此它们也被称为支链醇[6]。氨基酸与相应杂醇油的关系见表1。

表1 降解代谢机制中氨基酸的代谢产物Table 1 Metabolites of amino acids in metabolic mechanism of degradation

1.2 合成代谢机制（Harris代谢机制）

Harris代谢机制如下：

葡萄糖经糖酵解途径（embden-meyerhof-parnaspathway，EMP）形成丙酮酸，在乙酰羟酸合酶的作用下进入氨基酸的生物合成途径形成α-酮酸中间体，进一步在相应的脱羧酶和脱氢酶的催化下发生还原反应生成相应的高级醇。其中，α-酮酸脱羧酶普遍存在于酵母、真菌但在细菌中并不常见[7]。

在传统的白酒酿造过程中，杂醇油主要由酿酒酵母产生[8]。Ehrlich代谢机制和Harris代谢机制在酵母中参与杂醇油的合成存在一定比例，杂醇油中大部分低碳链醇是由酵母合成代谢机制生成的。据以往研究表明[9]高级醇中的低链醇如异戊醇、异丁醇和活性戊醇，75%由合成代谢途径生成，25%来自降解代谢机制，这可能是由于Harris代谢机制中的中间体丙酮酸较易转变为低分子的α-酮酸。若酒醪中的蛋白质分解不足，导致氨基酸含量偏低，则会加速糖类合成高级醇。

图2 Harris代谢机制Fig.2 Metabolic mechanism of Harris

2 白酒酿造过程中杂醇油的调控技术

2.1 通过优化发酵工艺降低杂醇油

2.1.1 酒曲比例的优化

酒曲被誉为“酒之骨”、“酒之魂”，其按制曲原料可分为麦曲和米曲。酒曲中的微生物一般包括霉菌、细菌和酵母菌；微生物在发酵时产生的各类酶与微生物共存于酒曲原料中，形成了集糖化力、蛋白质分解力和产酯力于一身的粗酶制剂[10]。因此不同酒曲间的差异不仅在微生物的菌落结构，所含酶的种类与数量及其活力也不尽相同。杂醇油是各类酶作用下的产物。

罗惠波等[11]在浓香型白酒酿造过程中的拌曲阶段分别梯度添加一定量的酵母、糖化酶、蛋白酶和α-淀粉酶，通过气质联用检测酒醅中杂醇油的含量。结果表明，添加糖化酶和干酵母的样品杂醇油产量较低；添加蛋白酶的样品，其杂醇油的产量增加，而α-淀粉酶的添加对杂醇油产量没有显著影响。孙金旭等[12-13]研究了酱香型白酒发酵过程中酶对杂醇油含量的影响，结果表明，添加糖化酶的实验组杂醇油总量降低了48.28%，糖化酶的添加对控制酱香型白酒发酵产生杂醇油具有显著效果。唐取来等[14-15]通过加入酶制剂或纯种培养酵母协同酒曲发酵得到的米香型白酒经工艺优化，其总酯、酒精度均有提高，而加入酵母的白酒其杂醇油含量也有所下降。

因此，无论何种香型的白酒，添加至酒曲中酶的类型和含量对杂醇油有一定的影响，其中糖化酶用量的增加能有效降低杂醇油的生成量，这可能是由于糖化酶用量的增加，淀粉更快地转化为还原糖，当酵母量充足的情况下，会迅速消耗糖分，而对氨基酸的作用不充分，从而降低杂醇油的生成。

2.1.2 发酵条件的优化

在白酒发酵过程中，杂醇油含量的高低与白酒的发酵条件息息相关。

在适当浓度的同化氮源下，酵母会优先利用氮源并生成氨基酸；在氨基酸含量充足的情况下，酵母通过降解代谢机制利用氨基酸合成杂醇油，与此同时，酵母通过合成代谢机制生成杂醇油的代谢通量会降低，综合作用使得杂醇油的合成量降低。杨生智等[16]在小曲白酒拌曲阶段添加不同氮源，对比五种同化氮源对杂醇油生成量的影响。实验结果表明，添加0.4%的碳酸氢铵能有效降低杂醇油的生成量。宋瑞滨等[17]以浓香型白酒作为研究对象，研究人工窖泥制作、用曲量、投料量、窖泥pH、不同发酵轮次、不同发酵周期等对正丁醇生成的影响，实验表明，窖泥配方不合理是造成正丁醇含量偏高的主要原因，同时加强窖池保养、适当提高用曲量和降低投料量，能有效降低糟醅正丁醇的含量。黄婷等[18]考察酵母接种量、糖化时间、发酵液料比以及发酵温度对米香型白酒的杂醇油含量和出酒率的影响，结果表明，合适的工艺条件能保证高出酒率的情况下同时降低米香型白酒中杂醇油的含量。HAN Q A等[19]在白酒发酵期间加入从苹果皮中提取的粗酶液，结果表明，从富士苹果中提取的粗酶液能降解醇类物质（正己醇、正丙醇、异丁醇和异戊醇）效果最佳，对于降低白酒中的杂醇油有较好的效果。不同香型的白酒因其原料，酒曲以及发酵工艺的不同，导致整个微生物系统在发酵过程中也截然不同。因此，杂醇油的控制应是考虑针对单一香型的白酒建立并优化一套实用合理的发酵工艺。

2.1.3 蒸馏条件的优化

蒸馏操作对于降低白酒中的杂醇油亦具有一定的效果。“掐头去尾”指掐去高酒精度的酒头，去掉低酒精度的酒尾，这主要是由于杂醇油属于一元醇类，其化学结构中含有的氢键导致杂醇油相比乙醇而言，其与水分子氢键缔合强度更弱而在蒸酒过程中更易挥发，因此，掐去酒头可以降低酒中杂醇油含量[20]。孙慧[21]认为仅通过“掐头去尾”的方式是无法一劳永逸地降低白酒中杂醇油的含量，截头虽然可以降低杂醇油的含量，但酒头中的总酯含量也高，尤其是呈香好，香味浓的乙酸乙酯，故“掐头”这一蒸馏操作取决于蒸馏酒中杂醇油含量是否超标。郭梅君等[22]利用慢速蒸馏结合精馏酒头降低米酒杂醇油含量，研究数据表明，当截取的酒头比例为10%～30%，杂醇油的去除率达到23.5%～60.0%，同时保留了白酒原有风格，使酒的香气和口感大大提升。

有效的蒸馏装备与优化的蒸馏条件固然可降低杂醇油的含量，但各酒厂的实际情况不同，其中可能存在蒸馏装置昂贵引起的投资成本大和风险高等问题，因此，可寻找合适的工艺方法，降低酒中杂醇油的含量。

2.2 通过筛选或改造微生物降低杂醇油

杂醇油是酵母发酵的副产物，其产量的多少最终取决于酵母代谢途径。因此，可围绕酵母菌种的选育开展研究，通过自然选育、菌种诱变或通过基因工程等方法获取低产杂醇油的酵母菌株。

2.2.1 选育低产杂醇油的菌株

自然选育用于筛选低产杂醇油的酵母菌是最为传统的育种方法。陈良强等[23]从酱香型白酒大曲和酒醅中获得一株低产高级醇且高产乙醇的粟酒裂殖酵母，其异丁醇和异戊醇的产量仅为其他粟酒裂殖酵母的51.0%和53.4%。梁璋成等[24]从福建红曲中通过设计温度梯度实验筛选低产杂醇油的酵母菌株JH301，在加入糖化酶和淀粉酶的无菌糯米培养基中进行培养，其杂醇油产量仅为117.12 mg/L。卫云路等[28]从酒曲中分离纯化一株同时具备低产杂醇油和高产酒精能力的酿酒酵母，并将其添加至米曲中，结合发酵新工艺，杂醇油含量明显下降。

利用微生物诱变育种选育低产杂醇油的菌株也是有效方法之一。朱莉娜等[25]通过微波诱变选育出低产杂醇油的啤酒酵母。王国正等[26]对低产杂醇油的酵母菌株CF4采用常温常压等离子体诱变方法，筛选一株杂醇油生成量降低了20%的酵母ARTP5。

张翠英等[27]将低产杂醇油酿酒酵母工程菌株加入到小曲酒的酿造中，以研究低产杂醇油的酵母菌对白酒发酵的影响，研究结果显示，酵母AYΔBAT2的添加对于采用半固态发酵的小曲酒而言，正丙醇、异丁醇和异戊醇分别降低了20.6%、32.3%和50.8%，同时对小曲酒的酒精度、残糖、总酸和总酯基本无影响。

使用低产杂醇油酵母，可减少白酒发酵过程中杂醇油的生成，但白酒是多种微生物混合发酵、共同作用下的产物。杂醇油的降低可能是一两种醇类如异丁醇或异戊醇含量的降低，但其他杂醇油物质的含量可能不变甚至增高。此外，部分细菌和真菌也能产生杂醇油，其代谢产物对改良的酵母菌株的影响机制尚不清楚，对于纯种发酵的啤酒而言，选育低产杂醇油的菌株是高效的途径；但对于混菌发酵的白酒而言，这未必是最有效的途径。因此，研究白酒发酵过程中微生物菌群与杂醇油产量的关系更加意义重大。

2.2.2 基因工程诱变育种

由基因Bat1p和Bat2p催化的Ehrlich途径的转氨酶反应是反应中主要的限速步骤，编码基因的缺失会影响杂醇油的形成[29-32]。ZHANG C Y等[33]以工业酵母菌株作为工程株，删除其编码BCAATases的基因BAT2，以减少黄酒发酵过程中产生的杂醇油，成功构建了BAT2单基因缺失二倍体突变株，产生的杂醇油含量显著减少，同时改造过的酵母菌株其生长和发酵性性能正常。

YOSHIMOTO H等[34]为了鉴定α-酮异辛酸酯脱羧生成异戊醇所涉及的酶和基因，对酶进行了部分纯化，并进行了质谱分析，遗传分析表明，在PDC1缺失突变体中，α-酮异辛酸酯脱羧酶活性和异戊醇产量部分下降，而在携带PDC1基因的多拷贝质粒的转移子中，α-酮异辛酸酯脱羧酶活性和异戊醇产量增加。这表明了酿酒酵母中的PDC1基因编码的丙酮酸脱羧酶部分地参与了α-酮异辛酸酯脱羧酶的脱羧作用，若删除该基因能降低酵母发酵中产生的异戊醇，但删除该基因对其生长与发酵性能的影响尚未有学者研究。李维等[35-36]以酿酒酵母AY-15作为实验菌通过分子育种技术对其单倍体α-5进行ATF1的过表达并使其缺失BAT2，单倍体重组后的杂交体经同样的培养条件，异戊醇和异丁醇的产量大幅下降。

DICKENSON J R等[37-39]报导的YDL080C基因编码的类丙酮酸脱羧酶是α-酮基异己酸生成异戊醇的代谢途径中的关键酶，敲除YDL080C基因可使异戊醇的生成量显著降低。李童等[40]构建YDL080C基因缺失工程菌产生的异戊醇含量与亲本并无明显差异，该实验结果与郝欣等[41]在酿酒酵母中的研究结果相同，说明类丙酮酸脱羧酶并非异戊醇的代谢途径中的关键酶。

低产杂醇油基因工程菌的构建及相关研究，采用的培养基不完全相同但风味物质的形成与培养基的成分密切相关[42-43]，因此，筛选低产杂醇油酵母的应用存在一定局限性。

2.3 降低杂醇油的其他技术

新酿酒的合理贮存可降低酒体中杂醇油含量，一般包括吸附法，生物膜透析法，机械过滤，重新翻烤或勾兑等方法[44]。HSIEH C W等[45]采用纳滤法和超滤法研究了白酒中杂醇油的去除效果，结果表明，纳滤膜去除酒中杂醇油的效率高于超滤膜，可去除酒中44%的杂醇油。

2.4 白酒酿造微生物与杂醇油的关系

白酒的酿造体系是霉菌、酵母和细菌相互作用下所形成的稳定的微生态系统，其中霉菌在白酒酿造过程中主要起糖化作用，部分霉菌如根霉其细胞含有的酒化酶可同时进行糖化和发酵，使得发酵速率提高导致小曲酒的出酒率上升，这对酒的风味和品质都具有重要的作用[46]。孙乐平等[47]经关联分析发现，异戊醇的产生与嗜热真菌属（Thermomyces）呈负相关，嗜热真菌属可能参与异戊醇的分解代谢，可能对高级醇的控制具有积极的效果。

在白酒酿造过程存在多种酵母的共同作用，其中酿酒酵母是优势酵母，具有较高的酒精发酵能力；非酿酒酵母，主要为产酯酵母，其产酒能力相对较弱，但在白酒酿造中可以将霉菌糖化产生的还原糖或其他微生物分解所得的氨基酸等前体物质转化为白酒的重要风味物质，如醛、酯、高级醇等[48]。DICKINSON J R[37]的研究结果表明酿酒酵母能将缬氨酸合成异丁醇。

细菌是白酒酿造中的重要微生物之一，是白酒香气来源的主力军。在浓香型白酒的发酵过程中，如梭状芽孢杆菌中的己酸菌和丁酸菌，会利用酒醅浸润到窖泥中的营养物质产生己酸和丁酸，在相关酶的作用下生成己酸乙酯和丁酸乙酯，形成浓香型白酒的特征香气成分[49]；梭状芽胞杆菌也是丁醇的天然生产者，它能在合适的发酵条件下产生大量丁醇[50]。在此外，乳酸菌在白酒酿造过程中不仅起产酸作用，同时也有利于酒醅中的成分发生美拉德反应，从而促进香气物质的形成[51]。白酒的酿造过程中，参与的微生物种类成百上千，若没有这些功能菌，也无法酿造各类白酒。

酵母与真菌之间相互作用，主要表现在酵母作为生物防治剂，对真菌有拮抗作用，丝状真菌则提供相应的水解酶类分解复杂的底物，为酵母的生长和发酵提供底物，而酵母将底物转化为乙醇和风味物质[51]。

目前国内关于白酒中微生物相互影响的研究鲜有报道，但白酒是多菌种混合发酵，发酵过程中微生物之间的协同、拮抗和抑制等相互作用是应予以重视。单菌种发酵对杂醇油形成的影响是必然的，而多菌种发酵对杂醇油的形成机制的具体作用机理，也是潜在的研究热点。

3 小结

白酒有多种香型之分，其酿造曲种与发酵工艺也不尽相同。从曲种的制备到原酒的贮存，每一步均有相应措施用以控制白酒中的杂醇油含量，但因香型多样，曲种不同，目前尚未能建立有效控制白酒中杂醇油含量的体系：工艺优化仅适用于个例，且成本高；选育低产杂醇油的菌株，实际应用的可行性不大且对其他微生物的生长代谢影响不明；改善蒸酒方式不能普遍应用于所有酒厂，酒厂需打造适合的蒸馏装置导致投资成本较高。因此，采用高通量测序技术、组学分析技术等生物技术以系统了解白酒中微生物的多样性、解析微生物菌群与杂醇油的关系、挖掘功能微生物可为控制白酒中的杂醇油含量提供新思路。