小球藻高价值活性物质研究现状及展望

郭瑞雪，杨 友，张诗雯，Qureshi Shahidmoin，顾嘉琦，武彩霞，刘进军，兰金苹

(1.河北北方学院 生命科学研究中心，河北 张家口 075000；2.河北北方学院 经济管理学院，河北 张家口 075000)

石油资源的日益枯竭及温室效应的逐渐加剧，使得人类迫切寻求更加洁净、绿色的可再生能源。与传统生物能源作物相比，微藻具有分布广、繁殖快、易培养、不与人争粮、不与粮争地、油脂含量高等特点[1]，二氧化碳固定率是C3植物的10余倍[2]，且本身富含多种高价值、高营养化合物，如蛋白质、多糖、脂类、色素、维生素、微量元素等，因此，微藻目前被认为是最理想的生物燃料、生物固碳及废水生物修复的开发对象[3-4]，而且是动物及人类健康的营养膳食添加剂[5]。一项经济可行性研究表明，由于微藻生产成本的限制，生物燃料的开发并非物有所值，除非在生产生物燃料的过程中伴随高附加值副产品的商业化生产[6]。若从提取油脂之后或高固碳后的藻中得到高附加值产品，即微藻能源、固碳过程与其保健品、健康产品及功能性食品的开发同步进行，不仅会大幅降低微藻能源的生产成本，而且将有不可估计的市场经济价值。

小球藻(Chlorella)为单细胞绿藻，不仅是国内外正在大力发展和培育的微藻能源与固碳藻种之一，而且富含磷酸多糖[7]、天然色素[8]、多种类胡萝卜素[9]、ω-3脂肪酸及多酚[10]等多种高价值化合物，具有抗氧化活性、抗炎、抗肿瘤、抗病原微生物等多种生物活性[11-12]。因此，小球藻作为可持续的自然资源代替合成的膳食添加剂，在预防、治疗人类疾病方面具有潜在的应用价值。为确保可持续生产具有营养和健康效益的高价值产品，必须解决微藻的规模化培养和生物精加工过程。目前，笔者所在的实验室前期工作中已经申请了2项专利，一是“一种微藻培养优化设备”[13]，能够在规模化、条件化制备微藻的同时提升油脂产量及提高固碳效率；另一个是“一种微藻收集和浓缩的方法与装置”[14]，解决微藻规模化培养难收集问题。最近，这2项专利已经应用到蛋白核小球藻(ChlorellapyrenoidosaFACHB—9)的规模化工业生产中。

本文主要以小球藻活性物质的神奇功效为出发点，探讨活性物质成分及作用机理、小球藻产品商品化应用存在的问题，为今后开发应用小球藻高附加值产品提供理论基础与科学依据。

1 小球藻功能性食品及健康价值

战争年代因粮食匮乏，一些国家利用野生小球藻来充饥，从此，小球藻被开发作为人类食物资源，成为理想的谷物替代品。小球藻商业化种植始于20世纪60年代的日本和台湾。20世纪80年代，美国、以色列、澳大利亚、中国和泰国开始大规模培养，小球藻成为主要的膳食添加剂。2013年，美国食品药品监督管理局(FDA)认证高产油的蛋白核小球藻S106为一般公认安全(GRAS)食品，市场上已有小球藻面条、饺子、饮料等食品在售，其中独有的活性成分是小球藻生长因子(chlorella growth factor，CGF)，也称为小球藻热水提取物，含有丰富的营养物质，致使小球藻以每20 h增长4倍的速度繁殖，并且使乳酸菌呈4倍增值[15]。小球藻附加值以饲料形式喂食猪，比粗粮喂食组生长速度显著增加，可提高血液中的IgA浓度及氮的代谢水平[15-16]。目前具有代表性的小球藻食品有日本Sun Chlorella公司的饮料、美国Shoko’s Natural Products生产的“CGF胶囊”、中国台湾绿藻工业公司的“绿寶CGF”以及中国广东绿安奇公司的“绿藻精”系列产品。大量基础及临床研究发现，小球藻由于富含高质量蛋白质、亚麻酸、多糖、核苷酸、多肽、维生素和微量元素等多种物质，表现出抗病毒、抗癌、抗氧化、消炎的作用，可显著改善高血糖、高血压及肿瘤病人的身体状况[17-18]。

尽管小球藻有很多健康价值，但还有大量研究表明摄入过量的小球藻可引发严重不良反应，如过敏反应、恶心、呕吐等胃肠道问题。2016年召回的Soylent产品因以小球藻藻粉为原料而引发过敏反应。另外，小球藻可诱发急性肾小管间质性肾炎，引起肾功能衰竭[19]。商业化的小球藻已经存在一定的不良反应，急需要开发适用于人类食用的新型藻种，此外，还有更多的生物活性化合物有待发现。因此，需开发一种检测潜在的有害代谢物的方法以及从微藻中提取目标化合物代替整个生物质的流程。

2 小球藻活性物质分离提取及生物学活性

小球藻中含有丰富的蛋白质、碳水化合物、脂肪、核酸、多种维生素及必要的矿物质，还富含植物色素，如叶绿素、叶黄素等，其基本成分见表1。

表1 小球藻的基本成分 mg

注：表中数据为每1000 g小球藻干粉中的基本成分含量。

2.1 蛋白质及多肽

蛋白质在藻细胞的结构和代谢中起着重要作用，是细胞膜结构及参与光合作用催化酶的主要成分。小球藻蛋白质与传统来源的蛋白质在数量和质量上均不同。小球藻蛋白质含量很高，尤其是蛋白核小球藻可高达60%以上，此外，小球藻含有哺乳动物不能合成的必需氨基酸及优质蛋白质，如乳球蛋白、卵清蛋白等，其氨基酸组成高于世界卫生组织(WHO)和联合国粮农组织(FAO)颁布的用于人类营养的蛋白质标准，作为高蛋白食品来源，小球藻能够迅速补充体能，因此被FAO列为21世纪人类的健康食品[20]。

小球藻细胞壁坚硬，只有破坏细胞壁及细胞膜，使内容物释放，才能提取蛋白质。破坏细胞壁的方法很多，其中高频超声法应用较广泛，但并不能完全充分释放内容物；酶解是一种非常有利的方法，它具有选择性高、副产物少、操作温度低的特点；还有许多其他方法裂解细胞壁，如锆珠、酸或碱处理、微波、脉冲电场等。但这些方法均会影响蛋白质提取的纯度及活性。Zhang等[21]开发了乙醇浸泡、酶消法、超声和均质技术相结合的方法，提取72.4%的小球藻蛋白质。从蛋白质中纯化生物活性肽是提高生物活性的必要条件，活性肽是蛋白质混合物通过硫酸铵或有机溶剂消除脂肪、碳水化合物等成分而获得。根据活性肽的分子量大小、疏水性和电荷等物理化学参数，可通过多种技术对其进行分离纯化，如膜超滤法、尺寸排除色谱法、反相高效液相色谱法和离子交换色谱法等。其中，反相高效液相色谱法(RP-HPLC)被认为是最有效的多肽纯化方法。另外，电膜过滤技术也是一种常用的纯化活性肽的方法，比膜过滤的选择性更强，可根据电荷和分子量分离生物活性肽，且不需要施加压力[22]。近年来。活性肽纯化技术已经取得了一些进展，但其商业化生产仍然面临着生产成本过高的挑战，在生产过程中可能会引起肽结构的改变，导致生物活性减弱或丧失。因此，对活性肽进行纯化时，需要同时考虑其有效性和经济性。

小球藻蛋白质具有一定的生物学活性，Moris等[23]从小球藻中分离出一种蛋白质的水解物，通过激发T细胞依赖的抗体反应和促进迟发性过敏反应来增强机体的免疫作用。发挥作用的蛋白质水解物一般为活性肽，小球藻中鉴定的活性肽不多，其中Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Glu-Phe和Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp这两段序列均表现出很强的抗氧化活性和DPPH自由基清除能力[24-25]。Ko[24]等对小球藻经蛋白酶水解后得到的酶解产物的抗氧化活性进行了研究，发现其酶解产物能够清除过氧化物、DPPH和OH-，同时能够降低AAPH引起的细胞凋亡和坏死，进一步证明了小球藻蛋白质具有清除体内自由基、延缓衰老的生物学活性。

人体血压的调节涉及许多复杂的系统，市场上有不同种类的治疗高血压药物，但多会引起不良反应，包括低血压、血管性水肿、咳嗽、头晕、头痛、恶心和肾损伤等。因此，从自然资源中提取抗高血压化合物具有重要的应用价值。研究发现，小球藻中含有的活性肽具有抗高血压的神奇作用，从藻类活性蛋白中提取的Val-Glu-Cys-Tyr-Gly-Pro-Asn-Arg-Pro-Gln-Phe、Gly-Met-Asn-Asn-Leu-Thr-Pro和Leu-Glu-Gln氨基酸序列能有效抑制人体血管紧张素转换(ACE)的合成。Ko等[26]用小球藻的活性肽提取物对大鼠进行实验，发现小球藻中序列为Val-Glu-Tyr的氨基酸对自发性高血压大鼠具有降压作用，进一步证实了小球藻蛋白质水解物具有降低血压上升的作用。

许多研究表明CGF中的蛋白质具有抗肿瘤的作用，对肝癌细胞、乳腺癌细胞、宫颈癌细胞等多种癌细胞的增殖均有抑制作用。Kunt等[27]采用明胶酶谱法研究了小球藻外分泌物对人体明胶酶的抑制作用，利用Western blotting技术对MMPs-1、MMPs-2、MMPs-9蛋白质表达进行分析，发现小球藻蛋白质提取液可以上调TIMP-3蛋白质表达，下调c-Jun蛋白质表达，进而抑制癌细胞中3种基质金属蛋白酶(MMPs)的表达，对乳腺癌的治疗有很大的应用价值。CGF对肝癌细胞HepG2的生长有显著的抑制作用，Wang等[28]采用低温高压提取、酶解、离子交换、凝胶过滤层析等方法在小球藻中分离出一种对肝癌细胞HepG2具有抑制活性的多肽CPAP(C.pyrenoidosaantitumor polypeptide)。Tanaka等[29]用小球藻CK22藻株的糖蛋白提取物对小鼠进行试验，结果显示其对小鼠的自发性肿瘤转移有抑制作用。

2.2 碳水化合物

碳水化合物可以附着在蛋白质或脂类(如糖蛋白和糖脂)上形成复合多糖，是小球藻细胞壁的主要结构特征之一。小球藻可以合成许多具有不同类型结构的碳水化合物，包括单糖、寡糖和多糖等，在细胞结构和细胞代谢方面均具有重要的生理作用。

小球藻活性多糖具有显著的抗肿瘤作用，Sheng[31]等从小球藻中提取出CPPSⅠa和CPPSⅡa两种多糖，由鼠李糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和1种未知糖组成，其中CPPS Ia中半乳糖含量最高，CPPS IIa中鼠李糖含量最高，这两种糖对肺癌A549细胞均表现出良好的抗肿瘤活性。Suárez等[32]从小球藻热水提取液中分离出一系列分子量不同但结构相似的磷酸化多糖，发现其具有刺激小鼠腹腔巨噬细胞合成一氧化氮(NO)的作用，并且高分子量的磷酸化多糖表现出的活性更高。进一步对多糖进行组分分析，显示多糖主链为β-D-吡喃半乳糖-(1→3)-β-D-吡喃半乳糖-(1→3)-，从小球藻中分离出的阿拉伯多糖(47 kDa)并未显示出刺激小鼠腹腔巨噬细胞合成NO的活性。施瑛[33]研究了小球藻多糖的免疫活性作用，结果显示小球藻中的多糖成分具有显著的免疫调节作用，作用强度与所用多糖剂量有关。藻细胞中的硫酸盐多糖(SPS)是研究最多的具有抗炎活性的碳水化合物，Kang等[34]发现从微藻中提取的硫酸-1-葡聚糖可以限制巨噬细胞NO和PGL2的产生，对炎症的产生具有抑制作用。还有研究表明，从藻种提取的硫酸化-岩藻多糖可以通过与细胞核的表面结合而减少炎症的发生，对机体炎症的预防具有显著作用[35]。

2.3 脂质

脂质是质膜的结构组成部分，中性油脂是多糖储存的能量储存体。小球藻的脂质分数主要是中性脂质，包括甘油酯、游离脂肪酸、类胡萝卜素(如β-carotene)和极性脂质，如各种磷脂和半乳糖脂类。藻细胞中的脂肪酸结构一般由C16和C18饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的混合物以及更长的碳链组成。饱和脂肪通常储存在中性脂质中，而不饱和脂肪酸则主要与极性脂质存在于不同的膜中，在不同的培养条件下维持膜的流动性。

从藻细胞中提取脂质通常使用非极性有机溶剂或溶剂混合物，如氯仿-甲醇和己酮-异丙醇。提取后使用额外的处理步骤，包括分馏或冬化，将多不饱和脂肪酸(PUFAs)从总脂类中分离出来。然而，由于含有杂质、气味、味道和浑浊的外观，仍然不适合人类食用，需要过滤、漂白、脱臭、抛光和添加抗氧化剂进一步净化。值得注意的是,萃取过程中使用大量溶剂引起了人们对健康、安全和环境的严重关注。因此，需要在溶剂回收、用绿色溶剂取代传统有机溶剂和执行更可持续的过程方面做出更多努力。

长链多不饱和脂肪酸在多种炎症病理中具有治疗作用，如阿尔茨海默病、关节炎和狼疮。越来越多的动物实验和体外实验支持微藻油的抗炎特性。Nauroth等[36]报道，使用二十二碳五烯酸(DPA)可以抑制脂多糖(LPS)刺激分泌白介素(IL)1β和干扰肿瘤坏死因子-α(TNF-α)在人类外周血单核细胞中存在。与对照组相比，喂食含有DPA(占总脂肪酸的16%)和DHA(占总脂肪酸的40%)的藻油的大鼠显著降低了足水肿模型大鼠的炎症反应。Banskota等[37-38]也报道了含有单半乳糖二酰基甘油的脂质提取物对264.7个巨噬细胞的抗炎作用。此外，在饮食中使用微藻油，特别是富含omega-3的脂肪酸，已被证明对偶氮甲烷诱导的结肠隐窝功能异常具有化学反应作用。CGF中含有的亚油酸、γ-亚麻酸等多种脂肪酸，对降低血压及血糖血脂也有显著的作用，同时富含多种不饱和脂肪酸，其中的二十二碳六烯酸(DHA)被称为“脑黄金”，可以促进脑细胞的生长发育，在保健产品及婴幼儿奶粉方面有广泛应用[39]。

2.4 色素

小球藻细胞中的总色素含量约占4%～5%，其中包含叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素。类胡萝卜素是包括脂溶性胡萝卜素和叶黄素在内的光合器官的组成部分，这些化合物可获得光能，同时也可作为光保护剂来抵抗自由基和恶劣的环境条件，如强烈的太阳辐射和紫外线。类胡萝卜素是由各种相关色素以不同的比例自然产生的，利用其广泛的作用可开发一系列高效益产品，有良好的发展前景和市场。

目前常见色素提取方法主要有有机溶剂浸提法、超临界CO2法和吸附树脂法。Kong等[40]研究了超声辅助提取法提取普通小球藻油脂分离叶绿素的方法，发现最佳提取参数为：提取温度61.4 ℃，提取时间78.7 min，乙醇体积79.4%，超声功率为200 W。在此优化条件下，小球藻活性物质中的叶绿素含量可达88.9%。

小球藻类胡萝卜素结构中存在大量的共轭双键或特定基团，使其抗氧化活性明显高于植物或合成类似物。这些化学基团通过清除活性物质中的自由基和单线态氧，将它们中和成危害性较小的分子，激活转录因子Nrf2，继而触发抗氧化基因在特定细胞和组织中的表达。近年来，许多国家都致力于小球藻添加到化妆品领域的研究。藻细胞中维生素种类齐全，维生素A能保护皮肤黏膜，维生素C可以分解皮肤中的黑色素，保持皮肤洁白细嫩，维生素E能延缓皮肤细胞衰老。日本越来越多的化妆品加入藻粉及藻精成分，多功能面膜及美容美发系列产品风行于美国、日本及西欧等国家。藻细胞中的类胡萝卜素可以延缓衰老，还具有抗炎特性，特别是虾青素因其抗炎作用而受到广泛关注。研究发现，虾青素(剂量为100 mg·kg-1)的抗炎作用比普通抗炎药物泼尼松龙(剂量为10 mg·kg-1)更为明显[41]。虾青素还可以抑制NO的生产，降低促炎细胞因子的水平，抑制肿瘤坏死因子和致炎细胞因子等[42]。藻细胞中的叶绿素不仅有促进肌肤新城代谢、延缓皮肤老化作用，在降低胆固醇、促进伤口愈合、治疗缺铁性贫血方面也具有显著功效[43]。小球藻中的叶黄素能够延缓慢性疾病的发生，同时还可以防止眼部疾病的发生并对心血管疾病也具有显著的防治作用[44]。

3 小球藻开发存在的问题

小球藻活性物质和提取的高价值副产品目前被用于营养食品和功能食品，其提取物的生物活性和经济价值已被广泛认知。但小球藻生物量中有许多未定义的生物化学物质、潜在的毒素和重金属，可能引起不安全消费并导致严重的健康状况，这需要进一步研发活性物质的纯化；另一方面，高价值的小球藻产品的供应受到生产总成本的挑战，包括栽培系统和维护、有限的培养生产力和生物精馏过程。虽然露天池塘是大规模养殖最经济的选择，但它们更容易受到污染，因此，如果所选菌株合成的有价值的产品能够证明该系统的成本是合理的，那么封闭的光生物反应器是首选。此外，收获和提炼生物质也可能非常昂贵，而且成本在很大程度上取决于所选择的过程。传统的提取高价值代谢物的方法往往依赖于使用有机溶剂，产品中的残留溶剂可损害健康。因此，超临界流体萃取和酶解等绿色技术被认为是分离高价值藻类产品的新兴技术。小球藻加工环节中的“干燥”和“破壁”能耗过高，涉及到高温、高压等条件，制约其产业化。为了维持蛋白质等活性物质的功能，细胞解体应在温和条件下进行，但会导致目标组分的提取率较低，故如何高效提取小球藻生长因子中的活性物质并进行产业化有待进一步探索研究。

4 结论与展望

小球藻活性物质在抑制肿瘤、抵抗炎症、防治慢性心血管疾病、增强机体免疫调节、防止氧化及延缓衰老等方面均表现出积极的生理作用，值得进一步研究和探索。小球藻在医学药品、功能性食品、化妆品及新型饵料领域有着巨大的开发潜力和发展前景，对藻类成分的探明及功能研究成果显著。虽然小球藻大规模培养及产业化面临许多挑战，但市场上对藻类产品的需求促使科研工作者对藻类物质作进一步研究，并有望取得更大的突破。