基于1H-NMR的七叶皂苷致静脉炎代谢组学研究

张晓兰，江翊国，沈 黎，张学会，潘 晨，赵 萍*

0 引言

七叶皂苷是从七叶树科植物天师栗的干燥成熟种子中提取的一种含酯键的三萜皂苷，主要通过刺激前列腺素的释放，导致血管收缩，降低血管壁对低分子蛋白质、水和电解质的渗透。在国外，七叶皂苷口服制剂作为非处方药，被广泛应用于治疗各种慢性静脉功能障碍[1]。在我国，七叶皂苷注射液通常用于治疗脑水肿、创伤或手术所致肿胀，也用于静脉回流障碍性疾病[2]。最新的临床研究表明，七叶皂苷在脑出血的治疗中也具有明显疗效[3]。随着其临床应用日益广泛，不良反应报道也越来越多，主要不良反应为静脉炎，表现为静脉穿刺部位有红肿、疼痛感或条索感[4-6]。但目前对于七叶皂苷与静脉炎的具体代谢关系尚无深入研究。

代谢组学(Metabonomics)是研究生物在多种因素作用下(疾病、药物、遗传、变异、环境)，内源性小分子代谢物的变化。相比于液-质联用(LC-MS)、气-质联用(GC-MS)，核磁共振(NMR)法因为高效、破坏性小、结构信息丰富等特点被广泛应用于代谢组学领域研究[7-8]。本文采用1H-NMR代谢组学技术研究七叶皂苷导致静脉炎患者与未发生静脉炎患者血液中代谢产物的差异，旨在发现容易发生静脉炎的潜在生物标志物和可能发生变化的代谢通路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2017年12月至2018年10月在江苏省人民医院盛泽分院因骨折入院的患者。入组标准：①入院后使用注射用七叶皂苷钠的患者。②患者住院前未服用其他药物，无基础疾病。排除标准：心、脑、肝、肾等重要器官严重功能障碍或不全的患者。用药期间根据患者发生静脉炎的情况分为发生静脉炎组和未发生静脉炎组。发生静脉炎组9例，男3例，女6例，年龄(50±21)岁。未发生静脉炎组11例，男5例，女6例，年龄(57±19)岁。两组患者年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。两组患者入院后除了七叶皂苷注射液，同时给予常规的手术、康复或止痛处理。

1.2 血样采集及前处理 患者入院后立即抽取静脉血约0.5 ml，4 ℃冷冻离心(4 000 r/min，5 min)，得到血清，置于-80 ℃冰箱中保存。检测前将血清样本置于冰水混合物中解冻，取血清250 μl加入到1.5 ml EP管中，加入750 μl的甲醇溶液沉淀蛋白，混匀，静置，4 ℃冷冻离心(10 000 r/min，10 min)，取上清，吸取450 μl至1.5 ml的离心管中，加入50 μl TSP重水，放入涡旋仪上震荡后混匀，4 ℃冷冻离心(12 000 r/min，10 min)，上清液装入5 mm核磁管中，进行检测。

1.31H-NMR分析条件 使用Bruker AvanceⅢ500 MHz核磁共振谱仪采集样本数据。采用弛豫编辑Carr-Purcell-Mei boom-Gill (CPMG)脉冲序列进行测试，参数为：自旋弛豫延迟为320 ms、自由感应衰减为32 K数据点、谱宽10 000 Hz，扫描128次。所有实验均在5 mm的探头中进行，测试温度维持在298 K。

1.4 数据处理 入组患者的性别、年龄差异采用SPSS 20.0软件进行统计学处理，采用χ2检验或独立样本t检验判断差异是否有统计学意义。

采用Topspin 2.1软件，将TSP作为化学位移的参考峰，定为0 δ。采用Mest Re Nova 9.0软件得到1H-NMR图谱，去除4.3～5.5 ppm区域残余水峰的影响。0.5～8.5 ppm区域内以0.015 为单位进行分段积分，所得积分值按每张图谱的总积分面积进行归一化处理。数据采用均值中心化预处理后先进行主成分分析(Principal component analysis，PCA)，主成分分析是对所有样本的总体分布趋势分析，初步判断各组间的分离程度、自然聚集状态及是否存在奇异样本，找出并剔除异常离散样本点，以保障数据分析的有效性。再通过采用正交矫正信号和监督性多维统计分析方法结合放大组间差异的正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal partial least square-discriminant analysis，OPLS-DA)和最大限度地通过排除不相关因素来区别各组分的正交信号校正偏最小二乘法判别分析法(Orthogonal signal correction partial least-squares discriminant analysis，OSC-PLS-DA)获得重要影响值。彩色荷载图(Loading Plot)用于寻找对组别分离有贡献的差异性代谢物，峰的颜色越红，代表这种代谢物在两组中的含量差异越显著，越蓝则表明差异越小。

2 结果

2.1 主成分分析 从图1可见，发生静脉炎组和未发生静脉炎组患者的代谢物存在重叠，未完全分开。

图1 发生静脉炎组和未发生静脉炎组PCA结果

2.2 正交偏最小二乘法判别分析 从图2可见，发生静脉炎的组分和未发生静脉炎的组分不重合的部分较多，表明存在大分子代谢物的差异。s-plot图中，离原点越远的点，越具有讨论的意义，越可能是差异代谢物，从图中可知，共标记出肌醇、磷酸肌酸、甲醇、葡萄糖、癸二酸盐等10种代谢物。

图2 发生静脉炎组和未发生静脉炎组OPLS-DA结果

2.3 正交信号校正偏最小二乘法判别分析法 从图3可见，两组虽然没有完全分开，但是重合的部分很少。s-plot图中，离原点越远的点，越具有讨论的意义，越可能是差异代谢物，共标记出亮氨酸、赖氨酸、甲醇、葡萄糖等11种代谢物。

图3 发生静脉炎组和未发生静脉炎组OSC-PLS-DA结果

2.4 彩色载荷图 通过彩色载荷图(图4)获得发生静脉炎组和未发生静脉炎组的候选特征峰。

2.5 与发生静脉炎相关的血清特征代谢物组的筛选 最终筛选得到 6 种具有显著差异的化合物，这些生物标志物的变化趋势结果见表1。

图4 发生静脉炎组和未发生静脉炎组VIP荷载

3 讨论

本文采用1H-NMR代谢组学技术研究七叶皂苷导致的静脉炎患者与未发生静脉炎患者血清代谢产物的差异，旨在发现容易发生静脉炎的潜在生物标志物。与未发生静脉炎的患者相比，容易发生静脉炎的患者血清中肌醇、甲醇含量明显增高，但亮氨酸、赖氨酸、磷酸肌酸、苯基丙氨酸含量明显下降。将这6种代谢物通过Metaboanalyst数据库[9]进行代谢通路分析。影响值大于0.1的通路见图5，共有2条代谢通路，分别为赖氨酸降解和苯丙氨酸代谢。赖氨酸和苯基丙氨酸为必需氨基酸，在分解代谢过程中转变为乙酰辅酶A参与三羧酸循环。容易发生静脉炎的患者体内的必需氨基酸含量下降，表明这部分患者存在氨基酸代谢紊乱。

表1 与七叶皂苷导致的静脉炎相关的血清代谢物

图5 代谢产物代谢通路富集分析

综上所述，本研究从代谢组学和代谢通路这2个方面研究七叶皂苷导致静脉炎患者与未发生静脉炎患者血液中代谢物与代谢通路的区别，发现容易发生静脉炎的患者存在氨基酸代谢紊乱。核磁共振代谢组学由于具有简单、快速和重现性好的独特优势，在评价药物疗效和毒理学研究方面具有巨大的潜力[10-11]，但本研究由于样本量有限，对于七叶皂苷致静脉炎的发生机制的代谢组学研究还需要更大范围和前瞻性的试验验证。