不同软木塞中2,4,6-三氯苯甲醚迁移量的检测和评价分析

秦燕飞，孙建平，陈佳威，梁蒙，任艳文

（中国长城葡萄酒有限公司技术中心/农业农村部酿酒葡萄加工重点实验室，河北怀来 075400）

软木塞污染是葡萄酒最严重的感官缺陷之一，造成软木塞污染的主要成分就是具有强烈泥土/发霉气味的2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）[1-2]。TCA是由一类生长在软木塞内的霉菌分解其生长环境中的2,4,6-三氯苯酚而产生的物质[3-4]。瓶装后，经木塞迁移到葡萄酒中的TCA比葡萄酒本身还稳定，而且痕量（2～10 ng/L）的TCA便会产生令人不悦的气味[1,5-6]，同时也会干扰消费者对其他香气成分的感知。美国食品药品监督管理局的研究报告表明，TCA的阈值水平一般是3.1 ng/L[7]。根据测算，全球每年因TCA污染而造成的葡萄酒损失可达100亿美元[8]。

虽然葡萄酒界也在致力于寻找软木塞的替代者，如高分子材料合成塞、玻璃塞、铝制螺旋帽等[9]，但它们在一定程度上缺少了葡萄酒长期熟成的有益性和开瓶时的高级感。因此，目前软木塞仍然是理想的葡萄酒瓶塞。按材料或加工工艺可将软木塞分为：天然塞（含填充塞）、贴片塞（1+1塞、0+1塞、2+2塞等）、聚合塞、加顶塞[10]，在此基础上又衍生出微颗粒塞、DIAM塞等[11-12]。

TCA在软木塞和葡萄酒中的含量都非常低，因此，高效的前处理萃取技术和灵敏度极高的检测方法是必不可少的。前处理方法有固相微萃取、液液微萃取和免疫亲和固相萃取等[5-6,13]，其中以顶空固相微萃取的使用为主。仪器检测方法有气相色谱-电子捕获检测器法、气相色谱-质谱联用法及其他检测方法（如离子流动性光谱法、酶联免疫分析法等）[5-6,14-15]，其中以气相色谱-电子捕获检测器法和气相色谱-质谱联用法的使用为主。目前，对于木塞中TCA的研究多为萃取技术、检测方法的优化，不同类别软木塞中TCA的迁移量及相应规律却鲜有报道。

本研究采用ISO 20752-2014[16]国际通用的检测方法，即HS-SPME-GC-MS（顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用）法对软木塞中TCA迁移量进行检测，在建立了成熟稳定的检测方法基础上，对不同厂家、不同类别的软木塞进行TCA迁移量的检测和评价分析，旨在对葡萄酒封装中软木塞的选择提供指导，最大程度上降低软木塞中TCA对葡萄酒的污染。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验所用软木塞来自8家不同木塞生产厂和贸易公司，采样时间2018年1月—2019年12月，每批次样品取样40个，密封包装后备用。

1.2 试剂与仪器

按照国际ISO方法[16]测定样品中TCA含量。

1.2.1 试剂

本方法使用符合GB/T 6682规定的一级水；四无乙醇（色谱纯），天津市光复精细化工研究所；无水乙醇和氯化钠均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）标品，纯度≥99%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh；2,4,6-三氯苯甲醚（TCA）-D5标品，纯度≥98%，Dr.Ehrenstorfer Gmbh。

1.2.2 仪器

岛津气相色谱-质谱连用仪（GC-MS 2010Ultra）；SPME固相微萃取装置；100μm PDMS SPME萃取头（安谱公司）；低极性石英毛细管柱：长30 m，内径0.25 mm，膜厚度0.25μm；固定相为5%二苯基和95%二甲基聚硅氧烷共聚物（RESTEK）；岛津不分流、无石英棉衬管；高纯氦气；分析天平：感量 0.01 mg。

1.3 实验方法

1.3.1 溶液配制

12%（V/V）乙醇溶液用无水乙醇配制。TCA系列标准溶液配制、TCA-D5标准储备液配制参照ISO方法[16]。

1.3.2 样品处理

在室温下将20个软木塞置于1 L广口瓶内，倒入乙醇溶液直至充满广口瓶，浸泡24 h后取出，作为样品溶液。称取1.5 g氯化钠于20 mL顶空样品瓶中，加入5 mL样品溶液和0.1 mL的TCA-D5标准溶液，压盖，备用。

1.3.3 顶空固相微萃取

平衡温度40 ℃，平衡时间5 min，搅拌速度250 r/min；萃取温度40 ℃，萃取时间30 min；解析温度250 ℃，解析时间5 min。萃取头老化温度260 ℃，老化时间1 min。

1.3.5 气质联用仪参数设置

进样口温度：250 ℃。升温程序：初始柱温70 ℃，以10 ℃/min升温至160 ℃，再以25 ℃/min升温至250 ℃，保持3 min。进样方式：不分流进样，1 mL/min。载气：纯氦气。色谱与质谱接口温度：250 ℃；离子源温度：230 ℃；溶剂延迟时间7 min。

2 结果与分析

2.1 检测方法的建立

前期已优化了萃取条件及仪器参数，如1.2所示。方法检出限以信噪比S/N=3表示，对TCA标准溶液逐级稀释，直至信噪比为3，此时TCA浓度为0.51 ng/L，即为该方法的检出限。本研究中低于检出限的均认为未检出。

依照1.3.2配制的系列标准溶液建立标准曲线，如图1所示。以TCA与TCA-D5的峰面积比为纵坐标，TCA浓度为横坐标，所得线性关系方程为：y=0.0663x；线性决定系数R2：0.9999；线性浓度范围：0.51～20.2 ng/L。

本研究对浓度为2.02 ng/L的标液进行了8次重复性试验，检测结果见表1。采用测定样品加标回收率来评价方法的准确度，结果如表2所示。

综上可以看出，该方法标准曲线的决定系数为0.9999，重复性的相对标准偏差为2.3%，加标回收率在98.1%～101.3%，检出限为0.51 ng/L，说明该方法准确、可靠，可用于检测木塞中的TCA含量。

2.2 不同类别软木塞中TCA迁移量分析

对2018年1月—2019年12月共计223批次软木塞进行了TCA检测，不同类别软木塞中TCA迁移量的整体情况如表3所示。检出率最高的是1+1塞，达60%；其次是聚合塞；微颗粒塞和天然塞检出率相对较低；而DIAM塞共检测33批次，均未检出TCA，这与DIAM塞的超临界CO2萃取技术[12]密不可分，同时也说明木塞生产过程中TCA处理技术的重要性。

从TCA迁移量分布来看，不同类型的软木塞差异较大，聚合塞中TCA迁移量范围分布最宽，最高为5.76 ng/L，并且检出的46批次中TCA迁移量的标准偏差也最大，说明聚合塞中TCA检出值的离散程度最高；1+1塞虽检出率最高，但TCA迁移量均在2.0 ng/L以下，检出样品的平均值为0.88 ng/L，迁移量范围稍宽；天然塞和微颗粒塞检出的TCA迁移量均在1.5 ng/L以下，范围值较低。由此发现，聚合塞是造成葡萄酒TCA污染的最大风险源。

将TCA迁移量最高的聚合塞按照不同范围值进行划分，如表4所示。TCA范围在1～2 ng/L的超过半数，占比54.3%，说明大部分的TCA迁移量分布在1～2 ng/L范围内；2～4 ng/L的占比接近20%；4 ng/L以上的占比为8.7%，而且平均值在5.1 ng/L。

对于软木塞TCA迁移量的限量标准国家尚未有明确规定，本文按照公司内控软木塞入厂检验标准对TCA的限定要求（即天然塞、微颗粒塞≤1 ng/L，聚合塞、1+1塞（聚合塞棒体）≤ 2ng/L），对不同类别软木塞的合格率进行汇总，如图2所示。1+1塞和DIAM塞合格率均为100%，天然塞和微颗粒塞合格率均在90%以上，而聚合塞的合格率最低，为87.76%。所以葡萄酒在软木塞选用中对聚合塞应慎重选择。

图1 TCA标准曲线Figure1 The standard curve of TCA

表1 重复性试验检测结果Table 1 Results of repeated test

表2 加标回收率试验检测结果Table 2 Results of recovery test

3 讨论与结论

本文通过对2年内收集的多批次不同类别软木塞中TCA迁移量的检测，初步认为DIAM塞为TCA“零污染”，主要原因是DIAM塞经过了“超临界二氧化碳萃取”这一特殊的技术处理，彻底去除了由软木塞带来的TCA污染[12]，现在越来越多被葡萄酒厂家选用，以确保葡萄酒固有的香气，让酿酒师有一种“放心感”。

聚合塞检出率高，合格率低，而且TCA检出值范围最宽，认为聚合塞对葡萄酒的污染风险程度最高。党国芳等[18]对不同类型软木塞装瓶180 d和360 d后的样品进行品评，发现聚合塞封瓶的酒部分出现木塞味，在香气方面表现明显不如其它瓶塞（天然塞、1+1塞）封瓶的酒表现强烈；冯韶辉[19]在试验中发现，浸泡聚合塞的酒液带有比较浓的粉尘味道，类似米糠味，而浸泡天然塞和1＋1塞的酒液，除带有轻微柔和的软木味道外，没有其他异味；李进等[20]也在实验品评中得出了类似的结论。聚合塞通常采用天然塞的边脚料和粘合剂制作而成[17,21]，生产过程中部分TCA并不能被去除，而且聚合塞密封性也较差，用此封装的葡萄酒货架期较短，一般用于快速消费的低端餐酒。随着葡萄酒市场的成熟，目前该类软木塞使用数量也逐渐减少，部分被微颗粒塞所替代。相比聚合塞，微颗粒塞颗粒更小，TCA去除相对彻底，弹性和密封性均比聚合塞好。本研究也发现微颗粒塞的TCA检出率较低，而且迁移量绝大部分（91.67%）在1.0 ng/L以下的可控范围内。

图2 不同种类软木塞TCA迁移量合格率Figure 2 Qualification rate of TCA migration in different types of cork

表3 不同类别软木塞中TCA检出率、迁移量范围和平均值Table 3 The detection rate,migration range and average value of TCA in different types of cork

表4 聚合塞中TCA迁移量不同范围占比和平均值Table 4 The proportion and average of TCA migration in different ranges in synthetic corks

本研究也发现，天然塞和1+1塞的TCA虽有检出，但整体上检出率和迁移量比较低，只要葡萄酒厂家选用可靠的供应厂商，并进行严格的入厂检验，TCA污染风险可控。另外，建议葡萄酒厂家可根据需要选用更高技术含量的产品，如目前很多软木塞厂家生产的“单只检验”的天然塞，即通过人为感官或设备逐个塞子进行TCA的检测，保证每一只塞子的TCA迁移量均在1 ng/L以下，适用于高端葡萄酒产品。

虽然，软木塞存在TCA污染的隐患，但仍然在葡萄酒使用中占据绝大部分的份额。据调查，天然软木塞不仅是中国消费者认知度最高的瓶塞，并且是他们的首选，这就要求软木塞生产厂家和葡萄酒生产厂家共同关注TCA污染的问题，保证消费者买到放心的产品[22-23]。软木塞的24 h浸泡试验能为短期瓶储的葡萄酒提供受TCA污染的危险指示，但是木塞本身有差异，而且封装葡萄酒一段时间以后，TCA还可能从木塞基质内部向酒中进一步迁移[24]，因此需要对封装后葡萄酒中TCA迁移量进一步跟踪研究。