双酶法制备豌豆肽及其抗氧化活性

宋明洋，刘晓兰*

齐齐哈尔大学食品与生物工程学院（齐齐哈尔 161006）

豌豆属于豆科植物，在中国各地均有栽种，分布在多个地区，如四川、江苏、湖北、河南、青海等[1]。豌豆营养价值高，富含蛋白质、维生素C、胡萝卜素和微量元素。和其他种类蛋白相比，豌豆蛋白是一种比较理想的植物蛋白，含有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸等必需氨基酸[2]。国内有关企业对豌豆的加工利用主要是采用其淀粉来生产粉条、粉丝等食品，没有充分利用豌豆蛋白，造成资源浪费。

豌豆蛋白中抗营养因子植酸、单宁的存在使其不能很好的被人体吸收利用。植源性生物活性肽由于其特殊的生理功能、良好的加工功能性、安全性高和生产成本低等优点具有较好的市场前景[3]。单酶水解制备的豌豆蛋白水解物具有增加免疫力、降血压、降胆固醇等生物活性[4-7]。但单酶水解的不足之处是由此制备的豌豆肽具有较低水解度和活性，而不同蛋白酶的作用位点有很大差异，采用双酶协同酶解是提高水解物短肽得率和水解度的可行方法。

试验以豌豆蛋白粉为原料，采用双酶水解的方法制备豌豆蛋白水解物，以Fe2+螯合能力为评价指标，对其水解产物的抗氧化活性进行初步研究，为豌豆蛋白的开发利用提供参考。

1 材料与设备

1.1 试验材料

豌豆蛋白粉（山东健源生物科技有限公司）；蛋白酶（南宁东恒华道生物科技有限公司）；菲啰嗪（生工生物工程（上海）股份有限公司）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 主要设备与仪器

DF-1型集热式磁力加热搅拌器（江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司）；PB-10型pH计（赛多利斯科学仪器有限公司）；TCL-16G型台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；PC/PLC-LD-53型冷冻干燥机（美国MILLROCK公司）；TU-1810型紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解方法

单酶水解方法：豌豆蛋白粉溶液（底物浓度10%）→调节反应pH→调节反应温度→加酶→恒温恒pH水解→高温煮沸（10 min）→冷却→离心（4 000 r/min，15 min）→上清液→冷冻干燥→豌豆肽冻干粉。

双酶水解方法：第1种酶水解后加入第2种酶进行水解，其他步骤同单酶水解方法。

1.3.2 水解度的测定

水解度（DH）的测定采用pH-Stat法[8]。

1.3.3 豌豆肽的抗氧化活性测定

Fe2+螯合能力的测定根据Kong等[9]的方法。

2 结果与讨论

2.1 不同蛋白酶对豌豆蛋白水解度的影响

根据蛋白酶生产厂家提供的酶最适反应温度及反应pH（表1），底物浓度10%且加酶量3.0%时，以DH为指标，比较5种蛋白酶对豌豆蛋白的水解效果，根据试验结果选出水解度较高的2种蛋白酶进行双酶分段水解试验。

研究蛋白酶种类对豌豆蛋白水解度的影响，结果见图1。

在试验所用5种酶里，复合蛋白酶酶解豌豆蛋白的水解度最高，为26.1%，其次是碱性蛋白酶，水解度为22.9%，风味蛋白酶和中性蛋白酶的水解度都在17%左右，木瓜蛋白酶的水解度最低，为5.7%。这主要和两方面有关：一是蛋白酶的作用位点，二是豌豆蛋白的自身组成。木瓜蛋白酶、中性蛋白酶的水解度最低是因为这2种蛋白酶的水解位点较专一；风味蛋白酶是氨基端外切酶，只能水解氨基端的氨基酸；复合蛋白酶由内切酶和端肽酶等组成，所以与其他种类蛋白酶相比有更多的作用位点；碱性蛋白酶是一种丝氨酸型的内切蛋白酶，作用位点广泛，专一性不强。此外，豌豆蛋白的等电点在pH 4.5附近，溶液从pH 4.6继续增加时，豌豆蛋白的负电荷增加，在静电排斥作用下，蛋白质结构发生变化，相互缠绕的分子伸展开，彼此之间的间隙增加。因此复合蛋白酶（简称P酶）和碱性蛋白酶（简称A酶）酶解豌豆蛋白的效果较好，选择这2种蛋白酶作为后续试验用酶。

表1 不同蛋白酶的反应条件

图1 不同种类蛋白酶对豌豆蛋白水解度的影响

2.2 单酶水解单因素试验

2.2.1 加酶量对水解度的影响

碱性蛋白酶和复合蛋白酶添加量对豌豆蛋白水解度的影响结果见图2。

2种酶酶解豌豆蛋白得到的水解度基本和酶底比呈正相关，A酶加酶量超过3.0%时有小幅下降，P酶加酶量超过3.0%时增长缓慢，这是因为在反应初始阶段，酶浓度较低而底物浓度较高，这对水解过程有促进作用，随着加酶量增大，水解度增加。但水解反应到一定程度时，底物浓度下降，此时酶添加量达到饱和，阻碍反应进行，水解度增加缓慢。酶是蛋白质中的一种，加酶量超过其最适加酶量时，酶分子中的一部分用来水解蛋白酶，阻碍酶对底物的水解，导致水解度下降[10]。故选择2种蛋白酶酶底比3.0%。

图2 酶底比对豌豆蛋白水解度的影响

2.2.2 pH对水解度的影响

pH对碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解豌豆蛋白水解度的影响结果见图3。

随着pH增加，A酶和P酶的水解度呈现出先上升后下降趋势，pH 9.5时A酶水解豌豆蛋白得到的水解度最大，pH 9.0时P酶水解豌豆蛋白得到的水解度最大。这是因为pH能影响酶活性部位上相关基团的一些活动比如解离等，进而影响与底物蛋白反应，但是酶只有在pH最适条件下，才能达到最大反应速率。pH过高或过低即不在酶的最适反应范围时会破坏酶的结构空间，从而改变酶的分子构象，降低酶活性甚至使其失活[11]。故选择A酶的最适pH 9.5，P酶的最适pH 9.0。

图3 pH对豌豆蛋白水解度的影响

2.2.3 温度对水解度的影响

反应温度对碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解豌豆蛋白水解度的影响结果见图4。

随着温度增加，2种蛋白酶的水解度呈现先上升后下降趋势，50℃时A酶水解豌豆蛋白的水解度最大，P酶水解豌豆蛋白在55℃时得到的水解度最大。这是因为不同酶的最适催化温度不同，酶解温度不在其最适反应范围时，会降低酶活性，而酶解温度过高时，会造成酶活性中心的次级键断裂，使酶失活甚至变性[12]。在低于最适温度时，升高温度能加快分子运动速率，从而增加底物分子与酶分子两者之间的结合几率，提高酶解效果。温度继续升高且超过酶的最适温度时，会破坏酶分子的空间构象导致酶变性失活，从而降低反应速率。故选择A酶和P酶的最适反应温度50℃和55℃。

图4 温度对豌豆蛋白水解度的影响

2.2.4 时间对水解度的影响

反应时间对碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解豌豆蛋白水解度的影响结果见图5。

随着时间增加，2种酶的水解度均呈现上升趋势，A酶酶解超过4 h、P酶酶解超过3 h后趋向平缓，这与酶反应动力学有关，在酶解反应初期，底物与酶特异性结合，大分子蛋白质被分解为多种混合物包括小分子肽和氨基酸等，酶解底物减少浓度降低会减少酶切作用位点，蛋白酶活性下降，另一方面，酶解产物的大量积累对酶解反应产生竞争性抑制，因此酶解反应进行一段时间后，水解度增长平缓。除此之外综合考虑到节约能源和时间，故选择A酶的最适反应时间4 h，P酶的最适反应时间3 h。

图5 时间对豌豆蛋白水解度的影响

2.3 单酶水解正交试验优化

在上述试验结果基础上，以DH为指标，固定温度，采用正交表对加酶量、pH、时间进行参数优化从而确定最佳工艺条件。

2.3.1 碱性蛋白酶正交试验优化

碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交试验因素水平表如表2所示。

表2 碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交试验因素水平表

碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交试验结果见表3，方差分析见表4。

表3 碱性蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交试验结果

表4 方差分析表

由极差分析可知，在水解过程中3种因素对水解度的影响依次为：B（酶解pH）＞A（加酶量）＞C（酶解时间）。依据极差分析确定水解工艺最优组合为A3B2C2，而9组正交试验得到的最优组合是A2B2C3，对2组试验进行验证和比较，A3B2C2水解度为33.8%，比A2B2C3的32.3%大，因此选择A3B2C2为最优酶解工艺组合，即加酶量3.0%、pH 9.5、酶解时间4.0 h。

2.3.2 复合蛋白酶正交试验优化

复合蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交试验因素水平表如表5所示。

复合蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交试验结果见表6，方差分析见表7。

表5 复合蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交试验因素水平表

表6 复合蛋白酶酶解豌豆蛋白粉正交试验结果

表7 方差分析表

在直观分析表中，由极差分析可知，在水解过程中四种因素对水解度的影响依次为：B（酶解pH）＞A（加酶量）＞C（酶解时间）。根据极差分析确定水解工艺最优组合为A3B2C3，而9组正交试验得到的最优组合是A3B3C2，对2组试验进行验证和比较，A3B2C3水解度为33.6%，比A3B3C2的26.95%大，因此选择A3B2C3为最优酶解工艺组合，即加酶量3.0%、pH 9.0、酶解时间3.5 h。由方差分析表可知，酶解pH对酶解豌豆蛋白影响显著（p＜0.05），加酶量和酶解时间对水解豌豆蛋白影响不显著。

2.4 双酶水解顺序对豌豆肽水解度的影响

双酶水解过程中不同的酶解顺序可能会对酶解效果有影响，因此用2种酶先后对豌豆蛋白进行酶解。

研究A酶和P酶酶解顺序对豌豆蛋白水解度的影响，结果见表8。

最佳酶解顺序为P→A，在此条件下得到水解度为39.61%。P→A的水解度大于A→P的水解度原因可能是P酶酶解豌豆蛋白暴露出来的位点有利于A酶的酶解，但A酶酶解豌豆蛋白暴露出来的位点不利于P酶的酶解，两者之间存在位点竞争。

2.5 豌豆肽的抗氧化活性测定试验

制备单酶、双酶酶解豌豆蛋白水解物，研究其抗氧化活性。

由表9可知，豌豆蛋白水解物对Fe2+螯合能力在一定范围内随样品蛋白浓度增大而增大。对于A酶，样品溶液质量浓度从0.050 mg/mL增加到0.125 mg/mL时，Fe2+螯合能力从7.85%增大到40.10%，对于P酶，样品溶液质量浓度从0.050 mg/mL增加到0.125 mg/mL时，其Fe2+螯合能力从12.93%增加到59.15%，对于P→A组，即双酶水解组，其对Fe2+螯合能力在样品溶液蛋白质量浓度为0.125 mg/mL时达到83.22%，是A酶组的2.08倍，是P酶组的1.41倍。综上所述，双酶水解豌豆蛋白获得的水解物其抗氧化活性与单酶水解相比有显著提高，这可能是由于双酶水解能增加蛋白酶的催化位点，使更多小分子游离多肽释放出来，而具有活性的多肽主要集中在小分子多肽中[13]，从而使双酶水解得到的产物具有更高的抗氧化活性，这与杜鹃等、胡二坤等[14-15]的研究结果一致。

表8 双酶水解顺序对豌豆蛋白水解度的影响

表9 不同酶解条件下豌豆蛋白水解物对Fe2+螯合能力的影响 %

3 结论

以水解度为指标，优化出双酶水解豌豆蛋白的最佳酶解工艺为：底物浓度10%，在复合蛋白酶加酶量3.0%，pH 9.0，温度55℃条件下酶解3.5 h；在碱性蛋白酶在加酶量3.0%，pH 9.5，温度50℃条件下酶解4.0 h。在此最佳工艺条件下酶解其水解度为39.61%，水解液蛋白质量浓度0.125 mg/mL时，对Fe2+螯合能力为83.22%，双酶水解工艺可显著提高豌豆蛋白的水解度和抗氧化活性。试验结果为充分利用豌豆蛋白提供新思路，为豌豆肽在保健食品等领域中的应用提供理论依据，从而提高豌豆附加值和扩大应用范围。