响应面法优化芦竹中芦竹碱提取工艺

李琳，杨培龙，李秀梅，潘方方，闫海洁*

中国农业科学院饲料研究所（北京 100081）

芦竹（Arundo donax）又名芦荻、江苇，多年生，禾本科芦竹属多年生植物。茎干直立挺拔，高2～6 m，茎粗1～2 cm，叶片宽大鲜绿，形似芦苇、竹子，但属于不同的植物。芦竹原产于匈牙利[1]，在中国南方地区有亚种。燃烧热值在16.8 kJ以上，且单位面积生物质能产量高，早期作为替代煤炭的生物质能源材料被引进中国。芦竹喜潮，在中国主要分布在广东、四川、浙江等地区，通常可以长到6 m。平均每年每公顷30～40 t的干物质量[2]。芦竹的适应性极强，由于其根系发达，蔓延性强，可以很好地吸收水分，所以耐干旱。不仅如此，芦竹还可在盐碱地、沙地等环境中生存[3-4]。芦竹有多种用途，可作为生物燃料，干物质直接燃烧热值为3 400 kJ/kg。它是世界上生长最快的陆地植物之一，对土壤耕作、肥料和杀虫剂的需要很少。欧盟公布芦竹是所有能源生物质作物中最有生产力和最低影响的作物[5]，并提议芦竹成为产生沼气的能源作物，自从2013年起，意大利已有25个农场种植芦竹[6]；芦竹还可防止水土流失[7]，对不同pH、酸碱度、含重金属离子的土壤具有修复作用[8]；芦竹被用于污水处理[9]；1937—1962年，在意大利，芦竹被用于大规模的纸张和溶解纸浆的工业基础中；芦竹在中国古代被当作牧草来饲喂牛羊，有研究表明，芦竹的蛋白质含量高，纤维含量低，可作为一种优质饲料原料，特别是芦竹幼嫩的枝叶是鸡、牛等喜欢的青绿饲料[10]；成熟芦苇作为原料，以其优良性能和管状形状被用作建筑材料，与竹子相似之处在于它们在建筑物中结合方式，但芦竹更灵活；芦竹还可用来制作乐器。

芦竹中含有多种生物碱，如芦竹辛、芦竹胺、芦竹碱等，芦竹碱又名格胺、克胺、禾碱、禾草碱、2-二甲氨甲基吲哚，纯净的芦竹碱为片状或针状白色结晶，熔点128℃，溶于醇、醚、氯仿，微溶于冷丙酮，几乎不溶于水和石油醚[11]，中国化学家刑其毅最先完成其化学合成与结构测定[12]。芦竹碱存在于芦竹、羽扁豆、麦芽、排前草中，芦竹中芦竹碱含量远远高于山羊草中芦竹碱含量[13]，具有多种生物活性[14]，是色氨酸的重要中间体，并在动物和人体的氨基酸代谢过程中发挥重要作用[15-16]。芦竹碱具有清热泻火作用，中医用于治疗热病烦渴、风火牙痛、小便不利，作用拟胆碱，可降低肾上腺素对平滑肌的影响[17]。芦竹碱对昆虫幼虫，如蚜虫有选择性毒性作用，但对哺乳动物无毒[18]。芦竹碱单体对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）具有抑制活性，可开发芦竹碱类生物农药[19-20]。芦竹碱还可作为防污活性物质[21]。

对于芦竹碱合成工艺的研究较多[22-28]，但对于芦竹碱天然提取的方法研究很少，有学者采用氯仿或乙醇、水、冰醋酸的混合溶液提取芦竹碱[29-30]，芦竹碱在水中溶解性较差。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芦竹（采自中国农业科学院高新技术产业园）；乙醇（分析纯，北京化工厂）；盐酸（分析纯，北京北化精细化学品责任有限公司）；氢氧化钠、三氟乙酸（分析纯，西陇化工股份有限公司）；芦竹碱标准品（分析纯，北京索莱宝科技有限公司）；乙腈（色谱纯）。

1.2 仪器与设备

SY-1000恒温超声提取机（北京弘祥隆生物技术股份有限公司）；高效液相色谱仪；ME-204电子天平、FE-28 pH计（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；YF114微型植物粉碎机（中国江阴市新友机械制造有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 芦竹碱标准曲线的制备

准确称取0.2 g芦竹碱溶于1 mL 70%的乙醇中，得到质量浓度0.2 mg/mL芦竹碱溶液，利用高效液相色谱仪测定上样量分别为5，10，15，20和25 μL的峰面积，以芦竹碱的质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到芦竹碱的标准曲线公式为Y=2E+07X+49 288，R2=0.998 3。

1.3.2 原料的预处理

芦竹收割清洗后于65℃的烘箱中烘干至恒质量，用植物粉碎机粉碎，过40目分析筛后保存于密封袋中，备用。

1.3.3 芦竹碱的提取

按照一定料液比，称取一定量芦竹粗粉置于500 mL烧杯中，加入一定体积分数乙醇，用盐酸溶液和氢氧化钠溶液调节至合适pH，在一定功率和温度下超声提取一定时间，静置0.5 h，取上清液于离心管中以8 000 r/min离心5 min，上清液过0.45 μm微孔滤膜，用高效液相色谱仪进行测定。

1.3.4 芦竹碱的测定

高效液相色谱法。色谱柱Venusil XBP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A，0.1%三氟乙酸，流动相B，乙腈；检测波长269 nm；流速1 mL/min；柱温30℃。程序：0～25 min 5%～100% B；25～30 min 100% B。

1.3.5 单因素试验与响应面优化试验

选取超声功率、提取时间、乙醇体积分数、提取温度、液料比值、pH这6个因素对芦竹中芦竹碱的提取得率的影响，各个因素的水平为：超声功率400，500，600，700和800 W，提取时间20，30，40，50和60 min，乙醇体积分数30%，40%，50%，60%，70%和80%，提取温度30，40，50，60和70℃，液料比值20，30，40，50和60 mL/g，pH 5，6，7，8和9。根据单因素试验，选出超声功率、超声时间和乙醇体积分数3个主要影响因素，利用响应面法对芦竹中芦竹碱的提取工艺进行优化。试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平

1.4 芦竹碱提取率的计算

1.5 数据统计与分析

数据采用Excel 2010计算，以±s表示，采用Design-Expert 8.06对响应面结果进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 超声功率对芦竹碱提取率的影响

如图1所示，随着超声功率增加，得率呈先增加后减少趋势，因为功率越大，空化效果增强，但是太大功率会产生大量空化泡，减少能量的传递，使得率降低[31]。因此，超声功率控制在600 W为宜。

图1 超声功率对芦竹碱得率的影响

2.1.2 超声时间对芦竹碱提取率的影响

如图2所示，在20～50 min超声时间内，芦竹碱得率明显上升，50 min时达到最大，之后得率随时间增加而下降。这是因为在超声作用下，随着时间延长，提取液能够更充分地渗入物料中，促进芦竹碱溶出，然而超声时间过长可能会导致芦竹碱降解。因此，超声时间控制在50 min左右。

图2 超声时间对芦竹碱得率的影响

2.1.3 乙醇体积分数对芦竹碱提取率的影响

如图3所示，乙醇体积分数30%～60%时，芦竹碱得率随着乙醇体积分数升高而增加，并在乙醇体积分数60%时，芦竹碱得率达到最大，随着乙醇体积分数继续增大，芦竹碱得率反而有所下降。原因是随着乙醇体积分数增大，溶解在有机溶剂中的芦竹碱量会随之增加，但乙醇体积分数增大到一定限度时，芦竹中其他物质会被提取出来，反而影响芦竹碱得率。因而选取乙醇体积分数60%为宜。

图3 乙醇体积分数对芦竹碱得率的影响

2.1.4 超声温度对芦竹碱提取率的影响

如图4所示，随着温度升高，芦竹碱得率呈现先上升后下降趋势，50℃时达到最大值。这是因为随着温度升高，体系黏度降低，加速传质过程[32]。温度过高可能会破坏芦竹碱结构，同时杂质浸出量增加，故选取最佳超声温度50℃为宜。

图4 超声温度对芦竹碱得率的影响

2.1.5 液料比值对芦竹碱提取率的影响

如图5所示，液料比值20～40 mL/g范围内，液料比值对芦竹碱得率影响不大，随着料液比继续增大，得率下降。考虑到后续浓缩回收工艺难度和节约原料原则，选择液料比值40 mL/g为宜。

图5 液料比值对芦竹碱得率的影响

2.1.6 pH对芦竹碱提取率的影响

如图6所示，在pH 5～9范围内，pH对芦竹碱的得率影响不大，因此选择pH 5左右。

图6 pH对芦竹碱得率的影响

2.2 响应面试验结果

2.2.1 回归模型的建立与检验

采用Design-Expert 8.06统计分析软件中响应曲面法的Box-Behnken模式，综合单因素试验结果，选取对芦竹碱得率影响显著的3个因素——超声功率（A）、超声时间（B）、乙醇体积分数（C），建立三因素三水平中心组合试验设计，共包括17个试验方案，其中12个析因试验点，5个中心试验点。试验设计方案及试验结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

以芦竹碱得率为响应值，建立影响因素和芦竹碱得率间的数学模型：Y=-1.166 88+4.689 98E-003A+ 0.015 266B+9.743 18E-003C-2.243 75E-006AB+ 1.373 77E-005AC-6.637 50E-006BC-4.252 66E- 006A2-1.291 36E-004B2-1.539 76E-004C2。

由表3可知，该模型p＜0.000 1，说明该二次回归方程极显著，失拟项（p=5.42＞0.05）显著，说明未知试验因素对试验结果干扰很小。决定系数R2=0.995 4，说明该模型对试验拟合情况较好，较好地反映芦竹碱得率与超声功率、超声时间和乙醇体积分数的关系。

表3 回归统计分析表

从表3中可以看出，超声功率、超声时间、乙醇体积分数、超声功率二次项、超声时间二次项、乙醇体积分数二次项、超声功率与乙醇体积分数交互项对响应值影响极显著，其他因素的影响不显著。

2.2.2 响应面分析

图7（a）～（c）反映在试验范围内3个因素的交互作用，同时第3个因素固定在零水平。综合比较6组图可知，等高线图c最圆，说明乙醇体积分数与超声时间的交互作用对提取芦竹中芦竹碱得率的影响最小，而等高线图b呈椭圆形，说明超声功率与超声时间的交互作用对提取芦竹中芦竹碱得率的影响最大。各因素对响应值的影响顺序为：超声功率＞乙醇体积分数＞超声时间。

图7 各两因素交互作用对芦竹碱得率影响的响应面及等高线图

2.2.3 最佳提取工艺验证

根据模型预测超声提取芦竹中芦竹碱的最佳工艺条件是：超声功率632.54 W、超声时间58.73 min、乙醇体积分数52.10%。在此条件下芦竹碱得率的预测值为1.000 25%。根据实际情况，调整优化条件为：超声功率600 W、超声时间5 min、乙醇体积分数60%、超声温度50℃、液料比值40 g/mL、pH 5。重复3次，进行验证试验，芦竹碱的实际得率为1.02%，与理论预测值接近（相对误差1.96%），说明响应面分析法适用于对芦竹中芦竹碱超声提取工艺进行回归分析和参数优化。

3 结论

试验利用超声提取芦竹中的芦竹碱，并考察单因素对芦竹碱得率的影响，在此基础上，通过响应面分析法得到芦竹碱最佳提取工艺为：超声功率600 W、超声时间50 min、乙醇体积分数60%、超声温度50℃、液料比值40 mL/g，pH 5。在此条件下，芦竹中芦竹碱得率为1.00%。试验采用Box-Behnken响应面法对芦竹中芦竹碱的提取工艺进行优化，为进一步开发提供科学、合理的理论和试验依据。