人工气候室条件下K326 和云烟87 烤烟品种吸收Se（Ⅵ）的动力学分析

韩 丹，熊双莲，郭笑恒，涂书新，许自成*，李志斌

1.河南农业大学烟草学院，郑州市文化路95 号 450002

2.华中农业大学资源与环境学院，武汉市洪山区狮子山街1 号 430070

植物在生长发育过程中，除大量元素外Zn、Cu、Mn、Fe、Se 等中微量元素亦必不可少。作为作物生长发育必需的微量元素之一，适量施用硒能调控植物呼吸和光合作用、抵御自由基过氧化伤害、提高作物抗逆性、提高产量，改善品质［1-2］。有研究表明，外源硒的施用能有效提高烤后烟叶安全性，施用适量硒肥能有效促进大田烤烟生长，改善烤后烟叶化学成分协调性［3］。植物主要从土壤中吸收利用有效态硒，由于其形态不同其吸收途径也不同［4-5］。目前生产中应用的硒肥多为硒酸盐Se（Ⅵ）和亚硒酸盐Se（Ⅳ）。有研究认为，与Se（Ⅳ）相比，植物对Se（Ⅵ）的吸收和转运速率更高，植物根系吸收Se（Ⅵ）后可直接通过木质部运输到叶片的叶绿体中，而根系吸收Se（Ⅳ）在根系中转化为有机硒化物，大部分留在根系中［6-7］，因此明确烤烟吸收Se（Ⅵ）的特征对富硒烟叶生产具有重要意义。

早在20 世纪50 年代，Epstein 和Hagen 在植物对离子的吸收研究中引入酶促反应动力学方程，Caassen 等［8］构建了植物吸收养分离子模型，以最大吸收速率(Vmax)和米氏常数(Km)定量描述植物根系对养分离子的吸收动力学特征，以此阐明环境条件对根系养分吸收的影响。目前关于烟草根系对硒的吸收机理已开展了大量研究［9-13］，Han 等［9］和Jiang 等［10］发现随着土壤中硒浓度的增加，烤烟根系中硒浓度呈显著增加的趋势；马一琼等［11］研究表明，烟株根系中硒含量随施硒水平增加而增加，而高硫水平则会抑制烟株对硒元素的吸收；罗勇等［12］研究认为，低浓度硒（1 mg/L）处理促进烟草生长发育，而高浓度则抑制；樊俊等［13］研究表明，相同浓度下Se（Ⅳ）和Se（Ⅵ）处理均能有效提高烟株各部位硒含量，Se（Ⅵ）处理较Se（Ⅳ）提高了3～30 倍。但关于不同环境条件下对烟草根系吸收Se（Ⅵ）的动力学参数的影响则鲜见报道。鉴于此，选取云烟87 和K326 为试验材料，通过水培试验，在不同pH、陪伴离子和抑制剂等条件下，对烟株根系吸收Se（Ⅵ）的动力学特征参数差异进行试验，旨在揭示不同环境条件下，烤烟根系吸收Se（Ⅵ）的动力学参数的变化规律和生物化学机制，为烤烟生产合理利用硒肥和改善烟叶品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试烟草（Nicotiana tabacum L.）品种为K326和云烟87。Se（Ⅵ）供体为硒酸钠（Na2SeO4，美国Sigma 公司）。

1.2 试验设计

将烤烟种子于25 ℃催芽，发芽后于蛭石+珍珠岩（1+1）的基质中培养，待植物长出1 片真叶时移栽至体积为10 L 的避光塑料盆中，选择大小一致的烟苗用1/4 Hoagland 营养液培养3 d 后，更换成1/2 Hoagland 营养液，3 d 后更换为全量营养液。生长期间每5 d 更换1 次营养液，每天用水泵及时通气，并补充水至10 L。育苗期间用去离子水浇灌，烟苗培养均在人工气候室中进行，光照条件为4 000 Lx、12 h/d，相对湿度为75%，在营养液中长至四叶一心时，选取大小均匀、长势一致的幼苗进行吸收动力学试验。采用离子耗竭法研究不同烤烟品种对Se（Ⅵ）的吸收动力学特征，硒浓度经预备试验确定为100µg/L。

Hoagland 营 养 液 组 成［14］：5 mmol/L KNO3、1 mmol/L NH4NO3、4 mmol/L Ca(NO3)2·4H2O、1 mmol/L NH4H2PO4、2 mmol/L MgSO4·7H2O、0.009 mmol/L MnCl2·4H2O、0.046 mmol/L H3BO3、0.000 8 mmol/L ZnSO4·7H2O、0.000 3 mmol/L CuSO4·5H2O、0.0001mmol/LH2MoO4、0.01mmol/LFe-EDTA。

处理方案：①选择大小均匀的云烟87 和K326烤烟幼苗，用去离子水仔细冲洗根部，并换成超纯水饥饿培养12 h，滤纸吸干水分后分别放入含有硒酸盐100 mL 0.5 mmol/L 硝酸钙中培养24 h，设置4 次重复，分别于试验的0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12.0、24.0 h 从溶液中吸取1 mL测定硒含量（体积分数）。同时补充1 mL 蒸馏水，每隔1 h 补充因蒸发、蒸腾而损失的水分，以保持溶液总体积为100 mL。试验结束后测定植株根鲜质量，并计算吸收动力学参数。

烤烟根系硒累积量：

Mi=（Co-Ci）×0.2/FW

式中：Mi 为i 时刻单位鲜质量根系的硒累积量；Ci 为i 时刻溶液的硒浓度（体积分数）；Co 为初始时刻溶液的硒浓度（体积分数）；FW 为根的鲜质量［15］。

②取样时间及方法同①，pH 设置为pH 5.0、pH 6.0、pH 7.0 和pH 8.0，pH 5.0 和pH 6.0 为2.5 mmol/L MES（含0.5 mmol/L Ca（NO3）2）缓冲溶液处理；pH 7.0 和pH 8.0 为2.5 mmol/L HEPES（含0.5 mmol/L Ca（NO3）2）缓冲溶液处理。分别用NaOH或HCl 调至相应的pH；

1.3 测定方法

采用氢化物发生-原子荧光分光光度计（AFS820，北京Titan 仪器公司）测定硒含量（质量分数）［14］。

1.4 吸收动力学参数的计算

参照张木［15］和韩丹［16］的方法计算吸收动力学参数：载体饱和时最大吸收速率Imax、解离常数Km和最小吸收浓度Cmin。

计算公式：

Imax=-bV/m

式中：b 为拟合一元二次方程的常数；V 为吸收试验溶液体积（0.1 L）；m 为根鲜质量。

Km=a-3b2/16c

式中：a、b 和c 为拟合一元二次方程的常数。

Cmin=a-b2/4c

式中：a、b 和c 为拟合一元二次方程的常数。

1.5 数据处理

采用Excel 2010 和SAS 8.1 软件进行数据处理和统计分析；采用Duncan’s 法进行数据间差异的多重比较(P＜0.05)；采用Origin 9.0 软件进行分析绘图。

2 结果与讨论

2.1 不同烤烟品种吸收Se（Ⅵ）的动力学参数变化

图1 表明，随着处理时间的增加，两个烤烟品种根系的硒积累量呈逐渐增加的趋势，在营养液处理培养24 h 时后趋于饱和。不同烤烟品种间硒累积量存在显著差异，云烟87 硒累积量显著高于K326（P＜0.05），云烟87 对Se（Ⅵ）硒源的饱和累积量达到10.2µg/gFW，为K326 的1.7 倍。然而黎妍妍等［17-18］的研究却发现，与云烟87 相比，K326 对Se（Ⅳ）的吸收速率更高，对硒的富集能力也更强。这可能是因为K326 对Se（Ⅳ）硒源更敏感，而云烟87对Se（Ⅵ）硒源较敏感。另外，同黎妍妍等［17］研究结果相比，烤烟对Se（Ⅳ）硒源饱和累积量只有Se（Ⅵ）硒源饱和累积量的40%～50%，这表明烤烟根系对Se（Ⅵ）吸收累积能力更强［14］。可能原因是烟草根系吸收的硒酸盐主要被转移到烟草地上部加以转化利用，以供给其他组织器官；而亚硒酸盐被植物根系吸收后，在根系直接被转化利用，只有极小部分会被转运到地上部加以利用［6］。

图1 不同烤烟品种硒累积量的动态变化Fig.1 Dynamic changes of Se accumulation in different flue-cured tobacco cultivars

不同品种烤烟对Se（Ⅵ）吸收动力学参数见表1。对不同烤烟品种的吸收动力学参数进行t 检验，结果表明云烟87 的Imax值较K326 显著提高55.01%，说明云烟87 对Se（Ⅵ）的吸收潜力较大；同时，云烟87 的Km和Cmin值均显著低于K326，说明与K326 相比，云烟87 对Se（Ⅵ）有更强的亲和力。而黎妍妍等［17］的试验发现，与云烟87 相比，K326 对Se（Ⅳ）的吸收潜力和亲和力更强，与本试验的结果不一致。

Imax、Km及Cmin是植物对土壤中营养条件适应能力的指标［19］。Cacco 等［20］对植物的离子吸收过程中Imax和Km表现出的不同情况提出了4 种假设：①高Imax和低Km类植物，适应于大部分营养环境条件；②高Imax和高Km类植物，适应于高营养环境条件；③低Imax和低Km类植物，适应于低浓度的养分环境条件；④低Imax和高Km则在任何浓度条件下均是不利的。在本研究中，与K326 相比，云烟87 属于高Imax和低Km的烟草品种，说明云烟87 对六价硒Se（Ⅵ）的营养条件适应范围较K326 更为广泛，但K326 和云烟87 两个烤烟品种在吸收四价硒Se（Ⅳ）时，云烟87 属于高Imax和高Km烤烟品种，因此云烟87 仅适应高浓度Se（Ⅳ）的养分条件［17］。

2.2 不同pH 对烤烟根系吸收Se（Ⅵ）动力学参数的影响

图2 表明，随着处理时间的增加，云烟87 和K326 的硒累积量趋于饱和，且均呈现出硒积累量为pH 6＞pH 7＞pH 8＞pH 5 的分布格局。在不同pH条件下，培养24 h 后两个烤烟品种硒积累量差异达到显著水平（P＜0.05）。说明在Se（Ⅵ）硒源的条件下，酸性条件（pH 5）对两个烤烟品种根系的硒积累量抑制作用最大，而弱酸性（pH 6）及中性条件（pH 7）下云烟87 和K326 对Se（Ⅵ）的吸收最为有利。这与黎妍妍等［17］研究云烟87 和K326 对Se（Ⅳ）的吸收试验结果一致，即弱酸（pH 6）及中性（pH 7）是烤烟对Se（Ⅳ）的吸收累积较适宜的pH条件。这进一步验证了Fordyce 等［21］的研究结果，当pH 越接近中性，硒对植物的有效性越高，越容易被植物吸收利用。

表1 烤烟根系吸收Se（Ⅵ）的动力学参数①(n=4)Tab.1 Kinetic parameters of Se(Ⅵ)uptake by flue-cured tobacco roots(n=4)

图2 不同pH 条件下烤烟根系硒累积量的动态变化Fig.2 Dynamic changes of Se accumulation in flue-cured tobacco roots at different pH values

不同pH 条件下烤烟吸收Se（Ⅵ）动力学参数变化趋势见表2。云烟87 和K326 两个烤烟品种Imax值呈现先升高后降低的趋势，在pH 6 时均显著高于其他处理，说明云烟87 和K326 均是在pH 6的条件下对Se（Ⅵ）有较快的吸收速率；而pH 6 时云烟87 和K326 的Km和Cmin均显著(P＜0.05)低于其他处理，说明在pH 6 时两个烤烟品种对Se（Ⅵ）的亲和力最强，更利于烤烟对Se（Ⅵ）的吸收；在pH为5.0～8.0 范围内，云烟87 的Imax值显著高 于K326，pH 6 处理提高54.99%，而Km和Cmin则显著低于K326，pH 6 处理的云烟87 的Km和Cmin较K326分别显著降低65.19%和76.29%，说明在pH 为5.0～8.0 范围内，与云烟87 相比K326 对Se（Ⅵ）硒源的亲和力较强。因此在不同pH 条件下，pH 6 和pH 7 更有利于烤烟对Se（Ⅵ）的吸收积累。有研究表明，在碱性和氧化环境中，硒酸盐Se（Ⅵ）是硒的主要形态，且在不同pH 条件下硒酸盐存在形式不同，其吸收机制亦不相同［22-23］，本试验中不同pH条件影响不同烤烟品种对Se（Ⅵ）的吸收，除烤烟品种本身存在差异外，可能与Se（Ⅵ）形态的变化有关。

表2 不同pH条件下烤烟根系吸收Se（Ⅵ）的动力学参数（n=4）Tab.2 Kinetic parameters of Se(Ⅵ)uptake by flue-cured tobacco roots at different pH values（n=4）

2.3 SO42-和PO43-对烤烟根系吸收Se（Ⅵ）动力学参数的影响

图3 表明，随着培养时间的增加，两个烤烟品种根系的硒累积量亦趋于饱和。SO42-和PO43-对云烟87 和K326 两个烤烟品种根系的硒累积量均有显著抑制作用，其中SO42-对两个烤烟品种根系硒累积量的抑制作用较大，分别为对照硒饱和累积量的21.7%和30.9%，说明SO42-显著抑制烤烟对Se（Ⅵ）的吸收。这与Liu 等［24］在油菜上的研究结果一致。

图3 SO42-和PO43-条件下烤烟根系硒累积量的动态变化Fig.3 Dynamic changes of Se accumulation in flue-cured tobacco roots under SO42-and PO43-conditions

表3 不同陪伴离子条件下烤烟根系吸收Se（Ⅵ）的动力学参数（n=4）Tab.3 Kinetic parameters of Se(Ⅵ)uptake by flue-cured tobacco roots under different ion conditions（n=4）

表3 表明，不同陪伴离子处理的两个烤烟品种对Se（Ⅵ）的吸收存在显著差异。K326 和云烟87烤烟的Imax值在SO42-存在时最低，比对照分别显著降低72.50%和82.26%，说明SO42-存在时烤烟对Se（Ⅵ）的吸收速率最低。两个烤烟品种的Km值和Cmin值在SO42-和PO43-存在时均显著高于对照，尤以SO42-存在时K326 和云烟87 的Km值和Cmin值分别比对照提高78.81%和160.77%、408.66%和990.98%，说明在SO42-存在时烤烟根系对Se（Ⅵ）的亲和力较弱，不利于烤烟根系吸收Se（Ⅵ）。除SO42-处理外，云烟87 的Imax值显著高于同一陪伴离子条件下K326 的Imax值，这说明在SO42-和PO43-存在条件下，云烟87 比K326 对Se（Ⅵ）的吸收速率快。然而，在不同品种间SO42-存在条件下K326 和云烟87 的Km值和Cmin值无显著差异，而PO43-存在时云烟87 的Km值和Cmin值比K326 分别显著降低31.25%和51.18%，说明PO43-存在时云烟87 对Se（Ⅵ）的亲和力相对较高。因此，在SO42-和PO43-存在条件下烤烟对Se（Ⅵ）的吸收有抑制作用，且以SO42-对烤烟Se（Ⅵ）吸收抑制性更强，这与黎妍妍等［17］的研究结果不同，PO43-对烤烟Se（Ⅳ）吸收抑制性更强。可能是由于不同价态硒吸收转运过程中的转运蛋白不同造成的，硒酸盐Se（Ⅵ）的化学性质与SO42-相近，且植物根系共用硫酸盐转运子运输Se（Ⅵ）和SO42-，造成Se（Ⅵ）和SO42-在植物吸收过程中激烈竞争吸附位点，SO42-存在条件下抑制Se（Ⅵ）的吸收，而亚硒酸盐Se（Ⅵ）的化学性质与PO43-相近，且植物根系共用磷酸盐转运子运输Se（Ⅵ）和PO43-［25-27］。

2.4 CCCP 和LaCl3 对烤烟根系吸收Se（Ⅵ）动力学参数的影响

图4 表明，随处理时间的增加，两个烤烟品种根系的硒累积量趋于饱和，呼吸抑制剂（CCCP）和通道抑制剂氯化镧（LaCl3）的施用对云烟87 和K326 两个烤烟品种根系的硒累积均有显著抑制作用，且以CCCP 的抑制效果较大。这也证实了植物吸收硒酸盐是以主动吸收为主的［28］。

图4 CCCP 和LaCl3条件下烤烟根系硒累积量的动态变化Fig.4 Dynamic changes of Se accumulation in flue-cured tobacco roots under CCCP and LaCl3 conditions

不同抑制剂条件下烤烟根系吸收Se（Ⅵ）动力学参数见表4。两种抑制剂处理的K326 和云烟87的Imax值均显著低于对照，以CCCP 处理最低，仅为对照的17.51%和16.13%。与对照相比，在CCCP和LaCl3 处理K326 和云烟87 的Km和Cmin均显著增加，且以CCCP 处理较高，说明使用外源CCCP 时烤烟对Se（Ⅵ）的亲和力最弱，不利于烤烟吸收Se（Ⅵ）。CCCP 和LaCl3处理K326 的Imax均显著低于云烟87，仅为云烟87 Imax的70.01%和68.18%，这说明抑制剂在两个烤烟品种对Se（Ⅵ）吸收的抑制作用上K326 显著高于云烟87。另外，抑制剂处理K326 的Km值和Cmin值均显著高于云烟87，说明添加抑制剂对K326 对Se（Ⅵ）的亲和力作用影响较大，而云烟87 对Se（Ⅵ）的吸收利用强于K326。本试验中呼吸抑制剂CCCP 和通道抑制剂LaCl3的处理对云烟87 和K326 两个烤烟品种Se（Ⅵ）的吸收有显著抑制作用，以CCCP 对烤烟吸收Se（Ⅵ）的抑制性较大。这是因为硒酸盐主要是通过主动吸收被植物根系吸收的［29-30］。

表4 不同抑制剂条件下烤烟根系吸收Se（Ⅵ）的动力学参数（n=4）Tab.4 Kinetics parameters of Se(Ⅵ)uptake by flue-cured tobacco roots at different inhibitor conditions（n=4）

3 结论

云烟87 和K326 对Se（Ⅵ）的吸收积累量和吸收动力学参数存在明显差异，其中云烟87 属于高Imax和低Km烟草品种，对Se（Ⅵ）的吸收积累及亲和力优于K326，且对Se（Ⅵ）营养条件适应范围较宽。在不同pH 条件下，pH 6 和pH 7 更有利于烤烟对Se（Ⅵ）的吸收积累；SO42-和PO43-存在条件下对烤烟Se（Ⅵ）的吸收积累和亲和力有一定的抑制作用，且以SO42-对K326 和云烟87 的Se（Ⅵ）吸收抑制性更强；外源添加呼吸抑制剂CCCP 和通道抑制剂LaCl3可显著抑制云烟87 和K326 对Se（Ⅵ）的吸收，以CCCP 的抑制作用较大。