香水莲花花粉的采集、干燥和贮藏特性研究

张慧会，周 琦，郭力宇，祝遵凌，c

（南京林业大学 a.南方现代林业协同创新中心；b.风景园林学院；c.艺术设计学院，江苏 南京 210037）

香水莲花Nymphaea hybrid系睡莲属Nymphaea多年生水生花卉，其花朵硕大，色泽艳丽，是良好的水面绿化和庭院观赏花卉。我国目前培育有9 种色系的香水莲花，故又名“九品香水莲”。其功能广泛，既可用于水湖造景和观赏切花，其花又能泡茶和药用，同时对大气、水体和土壤污染等也有一定的净化作用[1-2]，具有较高的观赏、经济和生态价值。9 种品系香水莲花的花期基本一致，在南京的开花期为6—11月初，夏季6、7、8月份的高温季节，香水莲花单花花期3 ～5 d，秋季9—11月，单花花期5 ～10 d 之久。在开花1 d 时，香水莲花花药不开裂或外层花药少量开裂，散出花粉；开花2 d 时，雄蕊群开裂散出大量的花粉。花粉是植物遗传、繁殖育种与种质资源研究工作所必需的材料，也是植物种质的形式之一，花粉的活力大小直接决定着杂交育种效率的高低和成败。目前，人工杂交育种依然是培育睡莲新品种的有效手段，选择最佳采粉期以保证较高的花粉活力是保持杂交育种成功率的关键。在睡莲杂交育种工作中，如果亲本自然花期不遇或者涉及到异地杂交问题时，需要对其花粉进行保存和运输。因此，研究花粉的贮藏条件对杂交育种和种质资源保存具有重要的理论价值和实践意义。

目前，对香水莲花的研究主要集中在化学成分和生物活性等方面[3-5]，而有关花粉活力变化规律和贮藏特性的研究尚未见报道。鉴于此，本研究以黄、粉、紫3 种不同花色的香水莲花品系为材料，对其不同开花天数的花粉活力、同一天不同时间段花粉活力、不同干燥方法和不同贮藏方法下花粉活力进行了研究，旨在探索香水莲花花粉的最佳采集期、干燥和贮藏的适宜方法，为今后开展香水莲花杂交育种研究和睡莲的种质资源创新工作提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以3 个应用较广、花色不同的香水莲花品系为试材：‘紫花型’香水莲花（紫色）、‘黄花型’香水莲花（黄色）和‘粉花型’香水莲花（粉色），均种植于南京江浦艺莲苑同一种植池内，种植密度为40 cm×40 cm，水深30 ～40 cm，进行常规养护管理。

1.2 试验方法

1.2.1 花粉活力的测定

试验于9月的晴天进行，测定前期每天选择次日将开放（花苞略有松动）的香水莲花花朵进行标记。早上10:00—11:00，一次性采集开花1、2、3、4、5 d 的3 种品系的香水莲花各6 朵，带回实验室，从每朵花中选择3 枚成熟的花药，将其花粉均匀抖落在干燥培养皿中并混合均匀，采用花粉离体萌发培养基法测定其花粉活力。具体步骤为：配置前期筛选出的最适培养基（0.001%硼酸+5%蔗糖+1% 琼脂+20 mg/LCaCl2），取待测花粉播于培养基上，置于30 ℃遮光培养箱中培养12 h 后，于显微镜下观察统计花粉的发芽率，每处理重复3次，每个重复观察5 个视野，每个视野内花粉数应大于100。统计时，萌发标准是花粉管长度≥花粉粒的直径。花粉萌发率计算公式如下：

式中：K为花粉萌发率；M为观测花粉总数；M1为已萌发的花粉数目。

在测定3 种品系香水莲花开花1 ～5 d 的花粉活力并确定其最佳采粉日后，分别在3 种品系香水莲花的最佳采粉日，测其一天之内不同时间段的花粉活力。从7:30—17:30 每隔1 h 采一次花药，选择3 种品系的香水莲花各5 朵，从每朵花中选择3 枚成熟的花药，置于离心管中，带回实验室后进行花粉离体萌发培养，统计发芽率，分析其花粉活力的日变化规律，以确定3 种品系香水莲花花粉的最佳采粉时间。

1.2.2 花粉干燥

在上述试验筛选出的最佳采粉时间内采集3种品系的香水莲花各5 朵，迅速带回实验室后收集花粉。每种品系的香水莲花花粉分别分成4 份，1 份用于测定新鲜花粉活力，另外3 份采用室内通风自然干燥法、烘箱干燥法和硅胶干燥法进行干燥处理，并采用花粉离体萌发培养基法对干燥完成后的花粉活力进行测定，以筛选花粉适宜的干燥方法。室内通风自然干燥法是将花粉平铺于硫酸纸上，置于室内通风处自然干燥24 h。烘箱干燥法是将花粉置于37 ℃烘箱中干燥24 h。硅胶干燥法是将花粉置于硅胶干燥器中干燥24 h。每隔2 h 观察一次，并测定花粉含水率。花粉干燥方法参考姚春潮等[6]、吴子龙等人[7]的研究方法，并通过预实验做相应的改动，当花粉含水率为4.5%～6.5%时，即干燥完成，用固体培养基法测定其花粉萌发率。花粉含水率根据以下公式计算：

式中：W为花粉含水率；Gs为新鲜花粉质量；Ggo为干燥后的花粉质量。

1.2.3 花粉贮藏

在上述试验筛选出的最佳采粉时间内采集3种品系的香水莲花各10 朵，带回实验室后收集花粉。用筛选出的最佳干燥方式干燥花粉，干燥完成后将每种品系的香水莲花花粉分装于离心管中，用医用注射器抽真空，分别储存在室温 （20 ℃）、低温贮藏（4 ℃）、低温冷冻贮藏 （-20 ℃）、超低温冷冻贮藏（-80 ℃）等4 种不同贮藏条件下，分别于5、10、30、50、70、90、120、180 d 后测定各个贮藏条件下的花粉萌发率，以确定香水莲花花粉的最佳贮藏条件。低温贮藏过的花粉先经过37 ℃水浴解冻30 min，然后再采用花粉离体萌发培养基法进行花粉活力的测定。

1.3 数据分析

用Microsoft Excel 对数据进行统计和图表制作，用SPSS 19.0进行方差分析以及多重比较（Duncan）。

2 结果与分析

2.1 不同开花天数的花粉活力变化

不同开花天数的香水莲花花粉活力检测结果如图1 所示。在开花后5 d 内，3 种品系香水莲花的花粉活力均随时间推移呈现先升高后降低的变化趋势。香水莲花在开花1 d 时，花药少量散粉，花粉活力较低。开花2 d 时，香水莲花花药大量开裂散粉，花粉活力也迅速升高，达到最高值。在3 个品系中，‘黄花型’香水莲花的花粉萌发率最高，为60.32%；‘紫花型’香水莲花的花粉萌发率最低，为48.25%。开花3 d 时，花粉萌发率均呈下降趋势；到开花5 d 时，花粉萌发率降至21.67%～28.20%，花粉活力较低。

2.2 花粉活力的日变化规律

由3 种花色香水莲花花粉活力高峰期的日活力变化曲线（图2）可见，一天之中不同时间段香水莲花花粉活力差异较大，花粉活力呈现单峰曲线趋势。‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花花粉活力的最高值均出现在10:30，分别为60.74%、57.24%、49.54%；11:30 花粉活力次高，分别为54.65%、50.27%、46.89%；其中，9:30—11:30 为3 种花色香水莲花的最佳采粉时间段。随着时间的推移，3 种花色香水莲花花粉萌发率均逐渐下降，到17:30 花粉萌发率均降至最低，分别为16.29%、17.73%、7.12%。3 个品系中，‘粉花型’香水莲花花粉萌发率的日变幅最大，‘黄花型’次之，‘紫花型’日变幅最小。

图1 不同采粉期对不同品系香水莲花花粉活力的影响Fig.1 Effect of different flowering days on pollen viability of yellow, pink and purple N.hybrid

图2 香水莲花花粉活力的日变化Fig.2 The diurnal variation of pollen viability of N.hybrid

2.3 不同香水莲花品系间花粉的活力

在香水莲花最佳采粉期采集3 种品系香水莲花花粉，并分别测定其新鲜花粉活力，结果如表1 所示。3 种品系香水莲花新鲜花粉活力均在45%以上，不同品系间花粉活力有一定的差异，其中‘黄花型’香水莲花的花粉活力最高，达60.61%；其次为‘粉花型’香水莲花；‘紫花型’香水莲花花粉活力最低，为48.15%。

2.4 不同干燥方式下香水莲花花粉的活力变化

3 种花色的香水莲花新鲜花粉分别经室内通风自然干燥、烘箱干燥和硅胶干燥等3 种处理后，花粉萌发率见图3。硅胶干燥法处理过的 3 个品系的香水莲花花粉萌发率均显著高于其他处理（P＜0.05），萌发率分别为58.31%、54.11%、46.88%，与新鲜花粉相比，花粉仍然具有较高活力；烘箱干燥效果次之；室内通风自然干燥效果最差。因此，硅胶干燥是3 个香水莲花品系花粉干燥的最佳方式，并且能较好地保持香水莲花花粉的活力。

表1 ‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花新鲜花粉的活力Table 1 Determination of pollen viability of yellow,pink and purple N.hybrid

图3 干燥方法对不同品系香水莲花花粉萌发率的影响Fig.3 Effects of drying methods on pollen germination rate of yellow, pink and purple N.hybrid

2.5 不同贮藏条件对香水莲花花粉萌发的影响

将3 种花色的香水莲花花粉分别贮藏在4 种不同的温度条件下，其花粉活力的变化情况如图4 ～6 所示。对不同贮藏条件下3 种花色香水莲花的花粉萌发率进行方差分析与多重比较，结果见表2 与表3。

由图4 ～6 可以看出，在不同贮藏条件下，3 种花色的香水莲花花粉活力在贮藏期间的变化趋势基本一致，均随贮藏时间的延长而呈现逐渐下降的变化趋势。方差分析表明，贮藏温度、贮藏时间对3 种花色香水莲花花粉活力的影响均达到了极显著水平（P＜0.01），贮藏温度与贮藏时间之间具有极显著的交互作用 （P＜0.01）（表2）。

图4 不同贮藏方式及贮藏时间对‘黄花型’香水莲花花粉活力的影响Fig.4 Variation of yellow N.hybrid pollen vitality with different storage methods and time

图5 不同贮藏方式及贮藏时间对‘粉花型’香水莲花花粉活力的影响Fig.5 Variation of pink N.hybridpollen vitality with different storage methods and time

图6 不同贮藏方式及贮藏时间对‘紫花型’香水莲花花粉活力的影响Fig.6 Variation of purple N.hybridpollen vitality with different storage methods and time

室温下贮藏的香水莲花花粉活力下降速度最快，贮藏5 d 后，‘黄花型’‘粉花型’香水莲花花粉已完全丧失活力，‘紫花型’香水莲花在保存10 d 后活力下降为0，说明香水莲花花粉不耐室温贮藏。

4 ℃贮藏条件下，3 种品系的香水莲花花粉活力均随贮藏时间推移而逐渐降低，但与室温贮藏相比，花粉的贮藏期限明显延长。4 ℃贮藏10 d后，‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花花粉活力下降较慢，分别下降了24.37%、33.06%、22.66%。贮藏30 d 后，‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花花粉活力下降幅度较大，分别下降了51.17%、60.58%、57.62%。贮藏至50 d 左右所试‘粉花型’‘紫花型’香水莲花花粉完全失去活力，‘黄花型’香水莲花花粉仍有活力，贮藏90 d后发芽力丧失。因此，低温（4 ℃）适于香水莲花花粉的短期贮存，其贮藏期限以不超过30 d 为宜。

表2 不同贮藏条件下‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花花粉萌发率的方差分析†Table 2 Variance analysis of pollen germination rate of yellow, pink and purple N.hybrid under different storage conditions

表3 ‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花花粉萌发率的多重比较结果†Table 3 Multiple comparisons of pollen germination rate of yellow, pink and purple N.hybridin different treatments

贮藏于-20 ℃和-80 ℃温度条件下的香水莲花花粉，其花粉活力的变化趋势较为一致，但于 -20 ℃温度条件下贮藏的香水莲花花粉活力下降速度更大。-20 ℃条件下贮藏30 d 后，‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花花粉活力下降幅度分别为24.28%、16.98%、20.22%，‘黄花型’香水莲花花粉活力下降幅度最大，从58.31%下降到44.15%。“粉花型”香水莲花花粉活力最低，由54.11%降至44.92%。-80 ℃贮藏条件下的下降幅度分别为14.39%、11.66%、9.34%，‘黄花型’香水莲花花粉活力下降最显著，从58.31%降至49.92%。‘紫花型’香水莲花花粉活力下降幅度最小，为54.11%～42.5%。-20 ℃条件下贮藏 90 d 后，‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花花粉活力的下降幅度为25.13%～34.15%； -80 ℃贮藏条件下的下降幅度为13.57%～18.8%。 -20 ℃条件下贮藏180 d 后，‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花的花粉活力分别为34.04%、30.51%、28.28%，均还可用于授粉；-80 ℃贮藏条件下贮藏180 d 后，‘黄花型’‘粉花型’‘紫花型’香水莲花的花粉活力分别为44.66%、41.36%、38.48%，均高于-20 ℃贮藏条件下保存的花粉活力，完全可以用来人工授粉。所以需要长期保存香水莲花花粉时，以低温（-20 ℃）冷冻保存或者超低温（-80 ℃）冷冻保存效果最好。

3 结论与讨论

确定花粉的最佳采集期，以保证花粉最高水平的成熟度，是决定贮藏后花粉活力能否保持较高水平以及后续杂交育种能否成功的关键[8]。本试验中，3 种品系香水莲花花粉活力在开花前2 d 升高幅度均较大；开花3 d，花粉活力均呈下降趋势。造成香水莲花花粉活力这一变化趋势的可能原因是：香水莲花花粉发育时间不同步，差别较大，随着时间推移，香水莲花花粉总体成熟水平达到最大，由未成熟发育至成熟的花粉数量越来越少，同时伴有大量花粉死亡，导致萌发率的下降。与刘莹等[8]研究有关铁线莲品种花粉活力变化趋势的结论一致，张亚利等[9]在梅花花粉萌发率的研究中也有类似结论。通过对香水莲花开花后2 d 内不同时间段花粉活力的观测发现，一天之中不同时间点3 个品系香水莲花花粉活力差异均较大，花粉活力呈现单峰曲线趋势，3 种花色香水莲花花粉活力的最高值均出现在10:30，9:30—11:30 为香水莲花花粉的最佳采集时间。因此，以香水莲花为父本进行授粉工作时应采集第2 天开花散粉的香水莲花花粉为宜，并选择在花粉活力较高的9:30—11:30 进行为好，避免过早或过迟采集花粉以影响杂交成功率。本试验中，3 种品系香水莲花的新鲜花粉活力存在一定的差异，这可能与株体的生长程度、营养状况、花芽发育情况等自身因素以及温度、光照等外部环境有关，但具体原因还有待后续深入研究。

贮藏条件对于花粉生活力的保持具有显著作用，一般认为贮藏温度和相对湿度是影响花粉活力的关键因素[10]。许多植物的花粉，若先经干燥处理后再低温贮藏，则花粉的保存效果更好，也就是说，在花粉储存期间，应尽可能保持较低的相对湿度[11]。不同植物花粉贮藏时所需的最适含水量不同[12-13]，史锋厚等[14]研究发现，当垂丝海棠的花粉含水量为10.35%时，其在合适的贮藏条件下仍然能长时间地保持较高的花粉萌发率；高芬等[15]认为当南京椴花粉贮藏时的含水量低于8.99%时，其花粉活力下降速率较快；李富生等[16]研究了不同无性系蔗茅花粉的贮藏条件，研究发现蔗茅贮藏时的花粉含水量适宜降至10%以下。本试验采用的3 种干燥方式中，硅胶干燥法对3 种品系的香水莲花花粉的干燥效果最佳，并且能较好地保持香水莲花花粉活力。但本研究只是在香水莲花花粉贮藏前进行了干燥方式的筛选，香水莲花花粉含水量对萌发的影响还有待进一步研究。

本试验对3 种品系香水莲花贮藏特性的研究结果表明，在4 种贮藏温度环境中，3 种品系香水莲花花粉活力均随着贮藏时间的推移而逐渐降低，贮藏温度、贮藏时间对花粉活力的保持具有极显著影响，贮存温度与贮存时间之间具有极显著的交互作用。3 种品系香水莲花花粉贮藏能力的排序均为：室温＜4 ℃＜-20 ℃＜-80 ℃，这一结果表明温度越低，越有利于香水莲花花粉活力的保持，花粉的贮藏能力越好，有关垂丝海棠[14]、茶树[17]、桃树[18]的研究中也有类似结论。3 种品系香水莲花花粉均不耐室温贮藏，花粉存放5 ～10 d 即失去活力，这与前人的结果基本一致[19-21]，可能是因为较高的室内温度增强了花粉的呼吸作用，营养消耗殆尽，同时由于外界环境的影响使花粉粒脱水死亡。4 ℃适于3 种花色香水莲花花粉的短期贮藏，贮藏30 d 时花粉萌发率均在19%以上。而 -20 ℃、-80 ℃的低温条件适于香水莲花花粉的长期贮藏，且-80 ℃下花粉的耐贮藏能力最好，贮藏180 d 后3 种品系香水莲花花粉活力仍在38%以上，说明贮藏温度是影响香水莲花花粉寿命的关键因子之一，且贮藏温度越低，香水莲花花粉的贮藏寿命越长，主要原因是低温使花粉细胞内的水分变成固态而无法被利用，抑制了物质代谢，降低了花粉呼吸强度与酶活性，因此延长了花粉的贮藏时间[22]。至于更低温度条件（-196 ℃）液氮贮藏对香水莲花花粉的贮藏情况尚待进一步研究。