金叶银杏硬枝扦插繁殖生根过程及其生根机制研究

王瑞敏，祝凌云，陈 颖，姚秀文，白景伟，陈 旭，张齐齐，曹福亮

（1.南京林业大学 a.南方现代林业协同创新中心；b.生物与环境学院；c.林学院，江苏 南京 210037； 2.南京昂科利医药科技创新研究院有限公司，江苏 南京 211100）

银杏Ginkgo biloba，又名白果、公孙树，其起源可追溯到3.2 ～3.3 亿万年前的古生代石炭纪，具有重要的科学价值，集材用、花用、果用、药用价值于一体，也是优良的园林观赏树种[1]。金叶银杏Ginkgo biloba‘Goldern-leaf’是南京林业大学、湖北安陆市林业局等单位的科研人员在对银杏叶色长期观察的基础上筛选出的一个芽变银杏新品种，其生态习性和普通银杏相似，具有很强的适应性。普通银杏只有在秋季时叶片才变为金黄色，而金叶银杏叶片在4—5月和9—10月都呈现橙黄色至金黄色，具有2 个观赏季节，特别是在春季，因而具有极高的园林观赏利用价值[2-3]。

由于金叶银杏是一种芽变性状，种子繁殖遗传性状不稳定，因而无性繁殖是金叶银杏培育的主要方式，目前金叶银杏的繁殖方式主要是嫁接繁殖，但是嫁接繁殖系数较低；组织培养可以实现快速繁殖，但目前体系还不健全，难以满足日益增长的市场需求，因此扦插繁殖是较优的一种快繁方式。对银杏的扦插有了一些研究，如邓荫伟等[4]利用根蘖苗条、王永格等[5]利用嫩枝、程贵兰等[6]利用硬枝进行了扦繁殖研究，岳剑云等[7]研究了枝条部位和年龄与不定根形成、非结构碳水化合物的关系，但对银杏不定根形成机制的深入研究不多，对金叶银杏扦插生根研究尚未见报道。

本研究通过对金叶银杏硬枝插穗进行不同生长调节剂处理，研究提高金叶银杏硬枝扦插生根率和成活率的技术措施，探讨金叶银杏的生根机制，为金叶银杏苗木扦插快繁技术体系的建立，快速、大规模地生产出具有优良遗传性状的银杏苗木，促进金叶银杏的产业化发展提供技术支持和理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验地概况及材料来源

扦插池设置在南京林业大学教学实验基地，插池基质为珍珠岩和蛭石的混合物（1∶1），底部铺有碎石。扦插前翻晒扦插池基质，于扦插前3 d平整扦插池，浇透水1 次，次日用0.3%的高锰酸钾溶液对基质进行淋洒消毒，3 d 后用水将高锰酸钾溶液淋洗干净。

1.2 插穗的采集、处理、扦插及管理

插穗来源于南京林业大学培育而成的金叶银杏嫁接苗。该嫁接苗是以湖北安陆地区芽变银杏母树上的芽为接穗，以南京林业大学银杏基地上的4年生实生苗为砧木嫁接培育而成[2-3]。3月8日，选取生长健壮、无病虫害的1年生金叶银杏枝条作插穗，扦插前将枝条剪成长10 ～15 cm 的茎段，要求上切口平切，下切口斜切。剪好的插穗捆好后分别放入含有α-萘乙酸（NAA）（200、500、800、1 500 mg·L-1）或者吲哚丁酸（IBA） （200、500、800、1 500 mg·L-1）， 以 及NAA+ IBA（200+200、400+400、600+600 mg·L-1）的不同 调节剂溶液中浸润1 h，以清水为对照。插穗浸入溶液深度为2 ～5 cm，每个处理30 根 （500 mg·L-1IBA 处理的60 根），3 个重复。扦插时插穗入土壤深度为7 ～8 cm，插后压实。

插池采用全光照自动间歇喷雾系统进行间歇浇水，每天淋水3 次，每次2 ～3 min，雨天停喷。扦插后每隔30 d 喷洒一次500 ～800 倍多菌灵消毒，常规管理。

1.3 插穗生根过程中生长指标的测定

插后每隔7 d 观察插穗愈伤组织形成及不定根的发生情况，随机抽取6 根插穗观察记录生根情况：愈伤组织出现期（d）、不定根出现期（d）等。插后4 个月（120 d），随机从各处理中的每个重复中抽取10 根插穗，进行生根率、根数、根长等指标的测定和统计。

1.4 插穗生根过程中生理指标的测定

用刀片剥取插穗基部2 cm 长的韧皮部放入自封袋中，液氮速冻后置于-80 ℃超低温冰箱保存，用于生理指标的测定。样品均取自于500 mg·L-1IBA 溶液处理的插穗，每个时间点随机取插穗18根，分为3 个重复，分别在扦插之前、扦插之后每隔20 d 取样，共6 次。

可溶性糖、淀粉采用蒽酮法测定，可溶性蛋白采用考马斯亮蓝法测定，超氧歧化酶（SOD）采用NBT 染色法测定，过氧化物酶（POD）采用愈创木酚法测定，以上方法均参照文献[8]；多酚氧化酶（PPO）参照张志良的邻苯二酚法[9]测定。内源激素测定（酶联免疫法（ELISA））参照徐澜[10]的方法测定。

1.5 数据分析与处理

采用Microsoft Excel 2016 进行数据统计和绘制图表，采用SPSS 20.0 统计软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 金叶银杏硬枝扦插生根过程观察

金叶银杏插穗生根属于愈伤组织和皮部混合生根型，有90%的不定根是从插穗基部愈伤和皮部的交界处伸出（图1A ～D），有少量不定根从插穗茎段芽点处产生（图1E）。NAA 和IBA处理的插穗尽管在生根时间上有差异，但整个生根过程表现基本一致（除1 500 mg·L-1的NAA 和IBA 处理外），可分为4 个阶段：愈伤组织诱导期（20 ～26 d）、愈伤组织形成期（26 ～42 d）、不定根发生期（42 ～53 d）、不定根形成期（53 ～ 79 d）。以500 mg·L-1IBA 处理的插穗生根过程为例，在第27 天时发现部分插穗基部切口处皮层开始膨大（图1A），第42 天时，插穗切口处产生白色点状突起（图1B），47 d 时，切口白色突起愈伤组织连接成环状，将切口包围。之后愈伤组织逐渐消失，基部进一步膨大开裂，至61 d时在插穗基部有白色根点长出，有的长至0.5 cm （图1C ～D），这时期插穗上芽的叶片也逐渐展开。在74 d 时，插穗基部已有4 ～6 个不定根（图1，F），之后不定根主要进行伸长生长（图1G ～H），叶片完全展开（图1I）。

2.2 不同质量浓度NAA 处理对金叶银杏扦插生根性状的影响

经不同质量浓度的NAA 处理后都能显著改善或提高金叶银杏插穗的生根性状和生根指标。其中500 ～800 mg·L-1的处理效果较好，愈伤组织形成期、不定根出现期都较对照和其他处理早，不定根出现期比对照分别提早了17 d 和8 d。 500 mg·L-1处理的生根率最高，达41.1%，比对照增加了147%；800 mg·L-1处理的生根率虽低于500 mg·L-1处理，但差异不显著，且不定根数比后者高。200 mg·L-1处理较前两者稍差些， 1 500 mg·L-1处理的生根率也高于对照，但其根数和不定根长都显著低于对照，说明该质量浓度对插穗生根有抑制作用（表1）。

2.3 不同质量浓度IBA 处理对金叶银杏扦插生根性状的影响

从表2 的数据来看，各IBA 质量浓度处理的效果优于NAA 处理。4 个IBA 质量浓度处理都显著改善了金叶银杏插穗生根的状况和提高生根指标，其中800 mg·L-1处理的效果最好，其愈伤组织形成期比对照提早了13 d，不定根出现期比对照提前了26 d，生根率最高达64.4%，比对照增加了2.86 倍，不定根长和不定根数分别增加了1.00和2.01 倍。尽管500 mg·L-1处理的各指标都低于 800 mg·L-1处理，但两者的根长和根数之间都没有显著差异（P＜0.01）。200 mg·L-1（低质量浓 度）和1 500 mg·L-1（高质量浓度）处理的效果也都显著好于对照，其生根率分别比对照增加了1.06 和0.88 倍，但总体效果 没 有500 mg·L-1和 800 mg·L-1处理好。

图1 金叶银杏硬枝扦插生根过程Fig.1 Cuttings rootting process of the Ginkgo biloba‘Golden-leaf’

表1 不同质量浓度NAA 处理下金叶银杏扦插生根指标的变化†Table 1 The changes of rooting indexes in Ginkgo biloba‘Golden-leaf’ cuttings under different NAA concentration treatments

表2 不同质量浓度IBA 处理下金叶银杏扦插生根指标的变化Table 2 The changes of rooting indexes in Ginkgo biloba ‘Golden-leaf’ cuttings under different IBA concentration treatments

2.4 NAA 与IBA 混合处理对金叶银杏硬枝扦插生根性状的影响

对银杏插穗进行NAA 和IBA 的混合处理后，发现混合处理插穗与单独NAA 和IBA 处理相比，其愈伤组织和不定根出现期都比单独500 或 800 mg·L-1相应质量浓度处理晚，但都早于对照；从生根指标来看，（200+200）mg·L-1和（400+ 400）mg·L-1混合处理好于单独NAA及IBA处理，另外（400+400）mg·L-1处理与最佳处理的IBA 相比可显著提高不定根数，达9.3 条，其生根率（51.1%）与单独IBA 处理无显著差异，说明混合处理对提高插穗的不定根数有益。（600+ 600）mg·L-1混合处理的效果都不及前两者，但仍好于对照（表3）。

表3 不同质量浓度NAA 与IBA 混合处理对扦插生根性状的影响Table 3 Changes on rooting indexes in Ginkgo biloba L.‘Golden-leaf’ cuttings under different levels of NAA and IBA treatments

2.5 金叶银杏扦插生根过程中关键酶活性和可溶性、淀粉含量的变化

从图2 中可以看出，对照和500 mg·L-1IBA 处理下的插穗韧皮部SOD（超氧歧化酶）活性均呈现出先上升后下降的趋势，但在500 mg·L-1IBA 处理下各时期的SOD 活性都显著地高于对照，且在插后40 d 达到高点，后出现缓慢下降趋势，而对照处理的SOD 活性在插后60 d 出现峰值，后出现下降。对照处理的POD（过氧化物酶）活性在整个扦插期内变化不大，在60 d 时达到高点，在100 d 时有所回升；而500 mg·L-1IBA 处理下插穗的POD 活性在插后40 d 内达到高点后出现下降，在60 d 时达到最低点（0 d 除外），后又出现上升，到第100 天后又高于第40 天时的数值。PPO（多酚氧化酶）的活性变化趋势同SOD 酶，也是先上升后下降，不过高峰出现的时间推迟，其中 500 mg·L-1IBA 处理在第60 天达到峰值，对照在第80 天（图2A ～C）。

500 mg·L-1IBA 处理的插穗可溶性糖在20 d 内出现上升，后逐渐下降，到第80 天后有所回升，除第40 天外都高于对照；淀粉的含量变化在初期与可溶性糖相反，在40 d 内显著下降，到60 d 后又逐渐上升（图2D、E）。

2.6 金叶银杏扦插生根过程中IAA、ZR、ABA含量的变化

从图3A 中可以看出，在整个扦插期内，IBA处理组插穗韧皮部的IAA 含量出现2 个峰值和一个谷值，即在0 ～20 d，IBA 处理组插穗中IAA含量显著升高；而在第40 天即愈伤诱导形成期时处理组IAA 含量大幅下降，然后开始回升；在第60 天，即不定根突出前的生根诱导期，IAA 含量达到第二峰值（此时比对照IAA 的含量高2.22倍），后又出现下降；到100 d 时，不定根伸长期时IAA 的含量低于对照。对照组插穗中IAA 含量的谷值在第60 天，比处理组推迟40 d，后IAA的含量又出现上升，但总体的含量都低于处理组 （0 d 和100 d 除外）。从图3B 中可以看出，扦插初期处理组的ZR 含量一直处于较低水平，之后开始上升，在第40 天时达到峰值，此时比对照达到峰值期（60 d）时的含量高60.1%，此后ZR 含量又大幅下降，至第60 天时达到最低并维持此水平至第80 天，到100 d 时又开始回升。对照组插穗ZR 含量在第60 天时达到峰值，但在前40 d 其含量显著低于处理组，在60 ～80 d 内又高于处理组水平。

从图3C 中可以看出，扦插穗生根过程中GA的变化趋势与IAA 变化呈相反趋势，即先下降后上升，且处理组各时间段的含量都低于对照。处理组的下降与上升的拐点在第80 天，比对照拐点时（60 d）GA 含量低40.1%，两者在第100 天时都有所回升。

从图3D 中IBA 处理的金叶银杏插穗中的ABA 含量在第20 天时达到高点，以后逐渐下降，到100 d 时ABA 的含量比0 d 下降了55.2%；对照组的ABA 变化趋势同处理组，但对照组在第40天时达到最高，尽管以后也出现下降，但各时间段的含量都高于处理组，第100 天时只比对照（0 d）下降了11.6%。

2.7 金叶银杏扦插生根过程中IAA/ABA、IAA/ZR、 IAA/GA 的变化

图2 IBA 处理对金叶银杏硬枝扦插生根过程中SOD（A）、POD(B)和PPO(C)活性及可溶性糖（D）和淀粉 (E) 含量的影响Fig.2 Effect of IBA treatment on the enzymes of SOD (A), POD (B) and PPO (C) and the contents of soluble sugar (D) and starch (E) in Ginkgo biloba ‘Golden-leaf ’ cuttings

从图4A 中可以看出在整个扦插期内，IBA 处理组和对照组的IAA/ABA 变化趋势大致相同，均表现为先下降后上升的趋势，而且都是在插后的第40 天（愈伤组织形成期）IAA/ABA 比值达到谷底，然后开始上升，到100 d 达到最高（不定根形成和伸长期）。不同的是整个扦插期内各时间节点的处理组IAA/ABA 比值均显著高于对照，说明高IAA/ABA 值可促进根原基的诱导和不定根的形成。

从IAA/GA 的变化趋势（图4 B）来看，在插后40 d 内处理组的IAA/GA 比值呈缓慢上升趋势，而40 ～60 d 内呈快速上升趋势，在60 ～80 d 内维持20 d 后又开始大幅下降，第100 天其比值接近对照水平。与处理组相比，对照组的IAA/GA比值在插后60 d 内变化不大，在第80 天出现小高峰之后在第100 天根的伸长期开始缓慢下降。

IAA/ZR 值变化出现波动变化，在扦插初期愈伤组织形成阶段，其比值呈下降趋势，处理组在第40 天降至最低值（谷底），到第60 天急剧上升到峰值，然后又开始下降，至100 d 其比值甚至低于对照。对照组插穗的IAA/ZR 值在插后60 d 内降低到谷底之后又快速恢复到初期值 （图4C）。

3 讨论与结论

目前，银杏扦插繁殖有2 种方式，嫩枝扦插和硬枝扦插[4-6]，扦插成活率大多在60%～98.4%之间。从研究中可以看出，金叶银杏扦插生根过程可分为4 个阶段：愈伤组织诱导期、愈伤组织形成期、不定根发生期和不定根形成期。生根类型包括愈伤组织和皮部生根2 种类型，为混合性，这与红缨海棠扦插生根类型相似[11]。从扦插结果来看，IBA 的处理效果要比NAA 的效果好，最高生根率达64.4%，NAA 和IBA 混合处理能提高不定根数，但生根率比单独的IBA（800 mg·L-1）处理的低，姜宗庆等[12]、王永格等[5]的研究也有相似的结果。因此金叶银杏扦插繁殖采用800 mg·L-1处理1 h，可以获得较高的生根率和能较早地生根。

图3 IBA 处理对金叶银杏硬枝扦插生根过程中IAA（A）、ZR（B）、GA（C）和ABA（D）含量的影响Fig.3 Effect of IBA treatment on the contents of IAA(A), ZR(B), GA(C)and ABA(D) in Ginkgo biloba cuttings

图4 IBA 处理对金叶银杏硬枝扦插生根过程中IAA/ABA (A) 、IAA/GA (B)、 IAA/ZR (C)比值的影响Fig.4 Effect of IBA treatment on the ratios of IAA/ABA(A), IAA/GA(B) and IAA/ZR(C) in Ginkgo biloba‘Goldern-leaf’ cuttings

IBA处理显著提高插穗生根率是个普遍现象，如100 mg/kg IBA 处理大马士革玫瑰枝条生根率最高达78.3%[13]，其原因可能与IBA 激活了插穗体内的SOD、POD 和PPO 酶活性，调整了可溶性糖和淀粉代谢，还与初期分泌大量的酚类物质有 关[14-15]。金叶银杏扦插生根过程中，基部的SOD与PPO 都出现先上升后下降的趋势，而POD 活性除60 d 有个谷值外，其它都是上升趋势，各酶峰值的时间有差异。3 个酶的活性变化规律与插穗生根过程形态变化相吻合，在扦插初期，由于剪切的原因使插穗受伤导致伤口和水分胁迫引起体内自由基含量上升，体内产生应激反应，保护酶SOD活性上升。而POD 和PPO 活性升高，可能是由于剪切作用刺激伤口处分泌酚类物质，促进了两个酶活性，有利于愈伤组织和不定根的形成。欧阳芳群等[16]也发现欧洲云杉插穗在扦插初期多酚类物质含量高，后期含量低有利于不定根的形成。扦插后POD 活性的升高还可能与生长素代谢和细胞壁的木质化有关[17-18]；而PPO 能够催化酚类物质与IAA 形成一种“IAA-酚酸复合物”的生根辅助因子，对离体插穗生根有积极的诱导作用[19]。 这些结果在山木通、凹叶厚朴、降香黄檀、四倍体刺槐等都有相类似的报道，说明这两种酶是插穗愈伤组织和不定根发生的关键酶[20-23]。

除此之外，糖代谢与愈伤组织形成和不定根发生关系密切。张恩亮等[24]在楸树扦插不定根发育的转录组分析中发现，随着楸树不定根的发育，参与糖酵解代谢的基因数减少而参与酚类物质合成的基因数量在持续增加。本研究中也发现可溶性糖在初期增加，后期减少与其转录组分析结果相吻合，说明在扦插初期愈伤组织形成过程中，存在着糖类的基因表达减弱而酚类物质的基因表达增强，由糖代谢逐渐向酚类代谢转变的过程。

生长素是扦插生根过程中起关键作用的激素，本研究发现，金叶银杏高的扦插生根率需要外源激素的添加，IBA 处理能够提高金叶银杏插穗IAA的含量，并呈现双峰现象，在第一个峰值（20 d） 时，可能是外源IBA 的辅助作用，刺激内源生长素含量增加，激活形成层细胞而诱导愈伤组织的形成。IAA 的第二高峰（60 d）与根原基出现相吻合，可能是在IAA 信号的传导过程中，激活了根原基形成层位点细胞的基因表达，诱导不定根的形成[25-27]。根原基出现与IAA 含量高峰相吻合的现象在白桦、北美香柏扦插研究中也有相似的结果[28-29]。

本研究中，ABA 含量在扦插初期略有上升，之后ABA 一直处于下降状态，其原因可能是由于切口的创伤刺激了ABA 的合成，调整可溶性糖和淀粉的比例，调整库强度，有利于不定根的形成。 吴文浩等[30]认为扦插过程中ABA 含量的下降，有利于插穗内的淀粉水解转化为糖，另外ABA是插穗切口受伤响应和有机物运输库强度的主要因素。从IAA/ABA 的比值来看，在插后的20 d （愈伤组织诱导期）和60 d（不定根形成）都处于高水平，可见金叶银杏插穗在生根的过程中，愈伤组织诱导和根诱导形成都需要较高的IAA/ABA 比值。这与野生长蕊杜鹃和北美香柏、糙叶杜鹃、枫杨、核桃、美国薄荷扦插过程中高含量的IAA 与高的IAA/ABA 比值有利于插穗根原基分化和生根结果一致[31-34]。程水源等[35]在银杏插穗生根的研究中也认为高比值的IAA/ABA 是不定根发生和生长的重要内部条件。

研究证明，赤霉素和细胞分裂素有抑制根原基的细胞分裂、分化和形成的作用[27]。本研究中，IBA 处理组的插穗 ZR 含量在40 d 出现峰值，后期一直处于较低的水平，而GA 含量在80 d 内处于下降状态，80 d 后开始回升，但整个时期含量都比对照低。另外在愈伤组织形成期（40 d），IAA/ZR 比值降低，不定根形成期（60 d），IAA/ZR 值又显著增大，说明高比值IAA/ZR 有利于不定根的形成，这是生长素和细胞分裂素含量彼此消长变化的结果，插穗基部形成高生长素，低细胞分裂素的生理状态，有利于根原基的形成[16,36]。

综上所述，金叶银杏扦插最佳的处理是 800 mg·L-1IBA 处理插穗1 h，NAA 及NAA+IBA处理也提高了金叶银杏的生根率，但效果不及IBA 好。IBA 处理改善了插穗基部糖代谢和酚类物质水平、激活氧化酶和调控内源激素的合成及比值关系。在插穗愈伤组织形成过程（20 ～40 d）需要的高SOD 和POD 酶活性，高的IAA、ZR 含量，低的GA 水平，低的IAA/ABA、IAA/ZR、IAA/GA 比值；而不定根形成过程中（60 ～80 d），需要高的PPO 和POD 活性，高的IAA 含量，低的GA、ZR、ABA 水平及高的IAA/ABA、IAA/ZR、 IAA/GA 比值。IAA 和ABA 的彼此消长是金叶银杏插穗生根的主要因素，ZR 与GA 起辅助作用，40 d 是愈伤组织向不定根转化的转折点。