马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 抑制作用的研究

康建英，芮 丽，何清伟，赵怡蕊

（1.山西中医药大学，山西 晋中030619； 2.山西省中西医结合医院，山西 太原030019）

肾细胞癌是一组源于肾小管上皮细胞的恶性肿瘤，是肾脏最常见的实质肿瘤［1-2］。目前，认为肾癌的发病多与生活方式有关，其中吸烟、肥胖、高血压与肾癌的关系最为密切［3］。肾癌“三联征”是常见的临床表现，即血尿、腰疼、腰部肿块，但不是所有患者三种症状都出现［4］。肾细胞癌是最容易产生耐药的肿瘤之一，其原因可能与肾癌细胞高表达多耐药基因有关［5］。寻找毒副作用小、安全有效的抗肿瘤药物是当前研究的热点。中医中药抗肿瘤是在中医基础理论的指导下，通过多环节、多靶点、多层次起到直接或间接的抑制或抗肿瘤的作用，毒副作用小，受到越来越多人的关注。邹燕勤教授认为中医中药在预防肿瘤复发、转移和改善患者术后生活质量方面有自己独特的优势［6］，通过西医手术治疗、定期复查与中医疗法条畅情志、药食并用相结合，能有效调节机体阴阳平衡，缓解临床症状，提高疗效，降低毒副反应，改善患者生存质量。

近年来对马钱子的研究越来越多，对马钱子的各种功效也了解得更多，其抗肿瘤作用受到重视。马钱子，又名番木鳖，为马钱科马钱子属植物马钱子及云南长籽马钱子的干燥成熟种子［6-8］，主要分布于印度、越南、缅甸和我国云南等热带、亚热带地区，味苦，性寒，入肝、脾经，毒性剧烈，具有通络止痛、散结消肿之功效［9］。现代药理研究表明，马钱子碱可抑制肝癌细胞、肠癌细胞、乳腺癌细胞等多种恶性肿瘤细胞的增殖，诱导细胞凋亡，起到抗肿瘤的作用［10-14］。迄今为止，尚未见到有关于马钱子碱对肾癌细胞抑制作用及相关机制的报道。我们拟通过研究马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 增殖、凋亡作用及对相关蛋白表达的影响，探讨马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 的作用及其作用机制，为临床治疗肾癌提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株与试剂 人肾癌细胞ACHN 系购自中国科学院细胞库；马钱子碱购自中国药品生物制品检定所；MEM 培养基、胎牛血清、胰酶（Gibco 公司）；PBS 溶液（Procell 公司）；噻唑蓝（MTT）（美国Sigma 公 司）；Annexin V-FITC/PI（ABGAB 公司）；DMSO（上海生工生物工程公司）；抗体DKK1、β-catenin、MMP-7、C-myc、辣根过氧化物酶试剂盒（HRP）、ELC 化学发光法检测试剂盒（英国剑桥Abcam）。

1.1.2 实验仪器 电热恒温培养箱（上海精宏）；常温离心机（Thermo 公司）；金属浴（杭州博日）；掌上离心机（其林贝尔）；液氮罐（四川东亚）；倒置显微镜（日本OLYMPUS 公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与保存 将含有1 mL 人肾癌细胞ACHN 悬液的冻存管在37 ℃水浴中复苏，迅速摇晃解冻，并加入4 mL 含10%优质胎牛血清的MEM 培养基中，离心，弃去上清液，吹匀；然后将所有细胞悬液按1∶2 到1∶5 的比例加入10 cm培养皿中，加入约8 mL 培养基，置于培养箱中培养，48 h 后换液并检查细胞密度。如果细胞密度达80%～90%，适时传代，保证细胞处于对数生长。传代达到细胞生长状态良好时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1 mL 含胎牛血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO，液氮中冻存。

1.2.2 MTT 法检测细胞增殖抑制情况 设0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL 马钱子碱组，取对数生长期的肾癌细胞，制备浓度为5×104/mL 的细胞悬液，以每孔100 μL 均匀接种于96 孔板中，边缘孔用灭菌的PBS 填充，置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中1 h 后，加入MEM 培养基，每个浓度设6 个平行孔，继续培养24 h、48 h、72 h；每孔加入5 mg/mL 的MTT 20μL，继续培养4 h；弃去上清，每孔加入150 μL 的DMSO，摇床摇晃10 min，待结晶全部溶解，用酶标仪在波长490 nm 处测定各孔的OD 值，按下列公式计算抑制率。细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值）/对照组OD值×100%。

1.2.3 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 不同浓度（0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL）马钱子碱处理肾癌细胞48 h 后，用胰蛋白酶消化细胞5 min 收集细胞，1000 r/min 离心5 min；弃去上清后，用冷PBS 过滤冲洗1 遍，1000 r/min，离心5 min，制备细胞悬液备用。调整细胞浓度为2-5×105/mL，加入100 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞，加5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI Staining Solution，轻轻混匀，室温避光孵育15 min。加入200 mL 1×Binding Buffer，细胞充分摇匀后，上机检测细胞凋亡情况。

1.2.4 Western 免疫印迹法检测相关蛋白水平 收集不同浓度（0 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL） 马钱子碱作用24 h 后的人肾癌细胞ACHN，PBS 液清洗，加入蛋白裂解液冰上裂解细胞30 min，12 000 转/分、4 ℃下离心15 min，取上清液，用Bradford 法测蛋白浓度。用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转到NC 膜上。用5%脱脂牛奶封闭膜2 h。在4℃下将膜分别与DKK1、β-catenin、MMP-7、C-myc 等一抗孵育过夜。然后将膜清洗3 次，每次15 min，并在室温下用HRP 结合的二级抗体孵育2 h，将膜清洗3 次，每次15 min。用ECL 试剂显示蛋白条，并进行分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件包进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，满足参数检验采用t检验；计数资料以频数表示，采用χ2检验；等级资料采用秩和检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 不同浓度马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 增殖的抑制作用

马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 增殖有明显的抑制作用，抑制作用随着马钱子碱浓度的增加及作用时间的延长而增强，呈明显的浓度依赖性和时间依赖性。各药物组与空白对照组比较，对人肾癌细胞ACHN 增殖抑制率的差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1、图1。

表1 不同浓度马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 增殖的影响 （±s）

表1 不同浓度马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 增殖的影响 （±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05

组别 n 浓度（μg/mL） 细胞增殖抑制率（%）24 h 48 h 72 h空白对照组 6 0 0 0 0低剂量组 6 100 15.06±1.631） 29.56±3.131） 36.67±3.051）中剂量组 6 200 28.78±1.991） 40.39±2.871） 55.33±3.091）高剂量组 6 400 60.11±2.271） 76.78±3.101） 83.17±3.851）

图1 马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 增殖抑制率曲线图

2.2 不同浓度马钱子碱对ACHN 人肾癌细胞的凋亡作用

不同浓度马钱子碱作用人肾癌细胞ACHN 48 h 后，凋亡率随着马钱子碱浓度的增加而逐渐升高，呈浓度依赖性；各药物组细胞凋亡百分率与空白对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见表2。

表2 不同浓度马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 凋亡的影响 （±s）

表2 不同浓度马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 凋亡的影响 （±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05

组别 n 浓度（μg/mL） 细胞凋亡百分率（%）空白对照组 3 0 2.61±0.25低剂量组 3 100 32.21±2.181）中剂量组 3 200 53.54±3.111）高剂量组 3 400 69.03±3.411）

2.3 Western Blotting 检测DKK1、β-catenin、MMP-7、C-myc 蛋白表达情况

不同浓度马钱子碱处理人肾癌细胞ACHN后，Western Blotting 检测结果表明，随着药物浓度的增加，人肾癌细胞ACHN 内DKK1 蛋白表达量逐渐增加，β-catenin、MMP-7 和C-myc 蛋白表达量逐渐降低（P＜0.05）。结果见图2。

图2 不同浓度马钱子碱处理人肾癌细胞ACHN 24 h 后DKK1、β-catenin、MMP-7、C-myc 蛋白表达情况

3 讨 论

中医药对肿瘤的防治有积极作用和独特优势，可增强肿瘤患者免疫力，减轻患者疼痛、水肿等临床症状，改善患者生活质量，提高放、化疗的效果，预防和降低不良反应，如有效控制或降低骨髓抑制、化学性静脉炎、手足综合征、周围神经毒性等化疗不良反应，放射性直肠炎、皮炎、耳聋等放疗并发症；抑制肿瘤的进一步发展，或可延长患者的生命，实现“带瘤生存”；预防肿瘤的复发与转移，对肿瘤患者的术后康复有积极意义［15-16］。

马钱子碱是中药马钱子的有效成分之一，在体内易吸收，且分布存在一定的差异，以肾中最多，但不易蓄积［17］。细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序死亡，细胞凋亡失调引起细胞无限增殖产生肿瘤，细胞凋亡主要通过外源性、内源性和应激性三种方式产生，这三种方式分别与细胞表面的某些受体死亡、线粒体介导、内质网介导有关［18］。马钱子碱对多种癌细胞增殖产生抑制、诱导细胞凋亡时表现出浓度依赖性，如乳腺癌、白血病等。多项研究表明，马钱子碱可以通过影响肿瘤细胞增殖与凋亡而产生明显的抑制作用。

Wnt 信号通路是一类在物种进化过程中高度保守的信号通路。Wnt 信号通路途径可分为经典的Wnt/β-catenin 途径和非经典途径（Wnt/PCP 通路、Wnt/Ca2+通路）。Wnt/β-catenin 信号通路可以影响多种生物过程，如细胞增殖、凋亡和血管生成等，β-catenin（连环蛋白）水平的高低在经典途径中起着重要的作用。正常情况下，经典Wnt 信号通路未被激活，各蛋白形成复合物，磷酸化βcatenin，后被蛋白酶体降解，此时的β-catenin 水平较低。当胞外的Wnt 配体与受体相结合（低密度脂蛋白受体相关蛋白LRP5/6 等），Wnt 信号通路被激活，激活信号被传递到胞质中的一系列蛋白中，导致蛋白复合物破坏，β-catenin 未被降解，而是被释放，此时的β-catenin 积聚水平升高，大量的β-catenin 与转录因子结合，激活下游靶基因转录。有研究表明，Wnt/β-catenin 与肾细胞癌可能有密切的联系，可能影响肾癌细胞的增殖凋亡和侵袭能力［19-20］。同时，经典Wnt/β-catenin 信号通路受不同的拮抗分子调控。DDK 特异性调控经典Wnt 信号通路，是一种重要的拮抗分子，DDK可以和受体LRP5/6 竞争性结合，产生调控作用。有研究表明，Wnt 拮抗剂失效对肾癌发生发展起着至关重要的作用［21］。此外，Wnt 途径的靶基因，在肿瘤的形成发展过程中起着重要的作用，如Cmyc 与细胞的凋亡相关，MMP-7 参与肿瘤进展。

本研究通过MTT 法检测不同浓度马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 增殖的抑制作用，发现不同浓度的马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 增殖均有明显抑制作用，在一定时间、一定浓度范围内呈浓度依赖性和时间依赖性；通过检测不同浓度马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 的凋亡作用，发现马钱子碱对人肾癌细胞ACHN 凋亡作用有显著的促进作用，在一定浓度范围内呈浓度依赖性；通过Western Blotting 检测DKK1、β-catenin、MMP-7、C-myc 蛋白表达情况，发现随着药物浓度的增加，ACHN 人肾癌细胞内DKK1 蛋白表达量逐渐增加，β-catenin、MMP-7 和C-myc 蛋白表达量逐渐降低，提示马钱子碱激活Wnt/β-catenin 信号通路参与肾癌细胞的凋亡，对肾癌的体外增殖可能有靶向抑制作用，这可能是马钱子碱抗肾癌机制之一。本研究仅证实体外马钱子碱对肾癌细胞的作用，体内马钱子碱对肾癌的作用还需进一步验证。