基于网络药理学的金银花抗炎作用机制研究

杨娟，于晓涛，郭丽娜，王单单，吴作敏，王瑞

(漯河市中心医院，河南 漯河 462300)

“金银花”一名出自《本草纲目》，由于忍冬花初开为白色，后转为黄色，因此得名金银花。药材金银花又名忍冬花(LonicerajaponicaThunb) ，为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花[1]。 金银花自古被誉为清热解毒的良药。其性甘寒、气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，如身热、发疹、发癍、热毒疮痈、咽喉肿痛等症，均效果显著。药理学研究表明，金银花具有抗炎[2]、解热、调节免疫功能、利胆、保肝、降血脂、降糖、抗血小板凝聚等生物活性[3]。但是，关于金银花抗炎的作用机制研究较多地停留在整体动物指标层面[4]，应用网络药理学方法的研究较少。不同于化学药通常作用于单一靶点，中医药的治疗作用体现在对疾病的辨证施治，强调整体性，体现了中药多成分-多靶点-多途径作用的理念[5]。由于中药的作用机制较复杂，所以深入研究存在较大困难，而通过网络药理学可将药物多成分、多靶点、多通路的关系展现出来，从而为探究活性化合物与其作用靶点之间的相互关系提供更好的方法[6]。本研究旨在寻找金银花中成药性、口服吸收较好的抗炎成分，并预测这些成分的抗炎作用靶点及相关通路，为金银花抗炎作用的深入研究提供参考。

1 方法

1.1 筛选金银花活性成分

通过中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)提取金银花的有关化学成分236个。在此基础上以OB≥20%(Oral Bioavailability，口服生物利用度)和DL≥0.1(Drug-Like，类药性)为条件对金银花活性成分进行筛选[7]，结合文献报道共获得40个活性成分。

1.2 金银花活性成分作用靶点筛选及“成分-靶点”网络图构建

通过TCMSP在线数据库将40个活性成分的作用靶点提取出来，并通过UniProt数据库以原则为物种为人(Human)作为前提对靶点数据进一步确认。将金银花的活性成分与相关预测靶点导入Cytoscape3.7构建金银花“成分-靶点”的网络图，再通过Network Analyzer插件分析以上网络图研究金银花活性成分和作用靶点的相互作用关系，以便寻找其活性成分与抗炎相关靶点[8]。

1.3 抗炎相关靶点搜集

Therapeutic Target Database(TTD，https://db.idrblab.org/ttd/)能提供可用作治疗的蛋白靶点和核苷酸靶点信息[9]，利用TTD在线数据库平台，把“anti-inflammatory”作为筛选条件，提取与抗炎相关的作用靶点。

1.4 抗炎相关靶点确认并构建成分靶点和抗炎靶点的PPI网络图

将TTD中得到的靶点输入String数据库[10]中预测靶点与靶点之间的相互作用关系，并选取分值>0.4作为蛋白之间相互作用的置信度依据。将结果输入Cytoscape3.7中构建抗炎靶点蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络。通过 Cytoscape3.7中Merge功能将化合物-预测靶点网络与抗炎的 PPI 网络合并，并通过构建的抗炎靶点网络系统分析金银花抗炎的靶点。

1.5 KEGG通路富集分析

获取的抗炎靶点利用DAVID数据库[11]进行KEGG通路富集分析，并以P≤0.05作为显著功能与通路的临界值。再通过Cytoscape3.7软件构建金银花抗炎作用活性成分-靶点-通路网络。

2 结果

2.1 金银花主要活性成分筛选

通过TCMSP在线数据库提取的金银花符合OB≥20%和DL≥0.1的活性成分有55个，再根据文献报道选取其中40个有相关靶点的主要活性成分作为研究目标，见表1。

2.2 构建金银花“活性成分-预测靶点”网络图

金银花活性成分-预测靶点网络(图1)中共包括263个节点(40个化合物节点与223个靶点节点)，组成了600条边，表示活性成分与靶点的相互作用关系。体现了金银花多成分、多靶点共同作用的机制。图中节点的大小表示度的大小，其中c40(槲皮素，quercetin)的度最大，有145个靶点，为网络的中心节点。其次重要的活性成分有芹黄素、山柰酚、毛地黄黄酮、β-谷甾醇、豆甾醇等。

2.3 筛选抗炎靶点并构建化合物-抗炎靶点网络图

通过TTD检测到9个与抗炎相关的蛋白，其PPI网络(图2)中，共有7个相互作用靶点，组成7条相互作用关系。使用 Cytoscape3.7 merge 功能将活性成分-预测靶点网络与抗炎靶点的 PPI 网络融合，取其交集部分，如图3所示。可观察到金银花中和抗炎有关的活性成分有7种，作用的主要靶点为有丝分裂原激活蛋白激酶(MAPK14)、E-选择素(SELE)、表皮生长因子受体(EGFR)、受体酪氨酸蛋白激酶erbb-2(ERBB2)。其中金圣草(黄)素、5-羟基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)铬酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羟基-7-甲氧基-铬酮、麦黄酮主要作用于MAPK14；山柰酚、槲皮素作用于SELE；毛地黄黄酮、槲皮素作用于EGFR和ERBB2。

2.4 KEGG通路富集分析和金银花活性成分-靶点-通路网络的建立

通过DAVID平台对所得7个金银花抗炎靶蛋白进行KEGG通路富集分析，以P≤0.05为条件筛选出18条信号通路，见表2。其中炎症信号通路有TNF signaling pathway；免疫信号通路有hepatitis C、epithelial cell signaling in helicobacter pylori infection；细胞增殖信号通路有ErbB signaling pathway、MAPK signaling pathway；低氧细胞应激信号通路有HIF-1 signaling pathway；激素信号通路有GnRH signaling pathway；癌症信号通路有proteoglycans in cancer、bladder cancer、endometrial cancer、non-small cell lung cancer、central carbon metabolism in cancer、pancreatic cancer、Prostate cancer。

通过Cytoscape3.7软件将活性成分-抗炎靶点与靶点-通路网络融合，见图4，可显示出金银花抗炎活性成分与靶点以及相关通路之间的关系。挑选出与炎症反应相关的通路，并构建抗炎相关的活性成分-靶点-通路图，见图5。由图5可以看出，金银花的抗炎作用主要通过靶点MAPK14、SELE、EGFR发挥。槲皮素、毛地黄黄酮为金银花主要抗炎成分。

图1 金银花“活性成分-预测靶点”网络图

图2 抗炎靶点相互作用

图3 金银花抗炎活性成分-靶点网络图

表2 金银花抗炎作用靶点KEGG通路

图4 金银花抗炎活性成分-靶点-通路图

图5 抗炎相关的活性成分-靶点-通路图

3 讨论

炎症是机体对于刺激的一种防御反应，表现为红、肿、热、痛和功能障碍。炎症，可以是感染引起的感染性炎症，也可以不是由于感染引起的非感染性炎症。近年来，关于滥用抗炎药所造成的抗药、并发症等问题也被频繁报道。炎症反应是一个复杂的过程，涉及到多基因与信号通路，而中药主要是通过多成分、多途径、多靶点的协同作用来获得治疗效果，由于疗效显著且副作用小的优点在炎症的治疗方面备受关注。

金银花主要化学成分为有机酸类、挥发油类、黄酮类、环烯醚萜类、三萜及三萜皂苷类和微量元素，自古被誉为清热解毒的良药。其性甘寒气芳香，甘寒清热而不伤胃，芳香透达又可祛邪。金银花既能宣散风热，还善清解血毒，用于各种热性病，为治一切内痈外痈之要药。从现代医学的角度上来讲，痈即是致病菌入侵在局部引起的炎症反应。关于金银花的抗炎作用，除了关于其含有的绿原酸、总黄酮类的抗炎作用多有报道外，各种文献报道多从其总提取物的抗炎活性方面进行讨论[12-14]。而本研究通过对获得的金银花的40种具有生物活性的化学成分进行分析，结果显示金银花中的金圣草(黄)素、山柰酚、槲皮素、5-羟基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)铬酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羟基-7-甲氧基-铬酮、麦黄酮、毛地黄黄酮显示抗炎活性，揭示了金银花发挥抗炎作用的主要成分。这些抗炎活性成分的主要作用靶点为MAPK14、SELE、EGFR、ERBB2、TNFRSF1A等。金银花中的抗炎活性成分可直接作用于 MAPK14、SELE、EGFR、ERBB2发挥抗炎作用，也可间接作用于其他靶点而发挥抗炎作用。其中金圣草(黄)素、5-羟基-7-甲氧基-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)铬酮、2-(3,4-二甲氧基苯基)-5-羟基-7-甲氧基-铬酮、麦黄酮主要作用于MAPK14；山柰酚、槲皮素作用于SELE；毛地黄黄酮、槲皮素作用于EGFR和ERBB2。结合图1和图5可看出毛地黄黄酮、槲皮素是金银花中OB和DL较高的主要抗炎活性成分，而MAPK14是金银花发挥抗炎作用的主要靶点。金银花主要通过TNF signaling pathway、MAPK signaling pathway两条信号通路发挥抗炎作用。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一组能被不同的细胞外刺激，如细胞因子、神经递质、激素、细胞应激及细胞黏附等激活的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。这些MAPK能被多种炎性刺激所激活 ,并对炎症的发生、发展起重要调控作用。EGFR是表皮生长因子(EGF)受体，同时也是 TGF-α受体。E-选择素是一种细胞表面糖蛋白，能够介导细胞与细胞、细胞与胞外基质相互黏附。E-选择素的表达是启动炎症反应的关键步骤之一。ERBB2(又名ErbB2, NEU, CD340)是原癌基因erbB-2编码的185 kDa的细胞膜受体，为表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)家族成员之一。ERBB2高表达肿瘤细胞中Ras-MAPK和PI3K-Akt信号传导活性较高，细胞增殖能力较强，分化成熟和凋亡机制受到抑制，细胞恶性程度高。结合靶点与通路分析，可看出金银花中抗炎活性成分可能通过以下4种方式发挥抗炎作用：减少促炎细胞因子的产生、阻断促炎因子与相应受体的结合、抑制启动炎症反应的关键蛋白的表达、调控细胞增殖从而间接调控炎症反应。

本实验通过网络药理学的方法显示出金银花“多成分-多靶点-多通路”的抗炎作用机制，成功地预测了金银花抗炎作用的主要成分、主要作用靶点与相关的信号通路，但研究结果仍需要通过进一步的实验加以验证。