基于InDel分子标记的云南地方稻籼粳属性与表型性状相关分析

陈越 陈玲 丁明亮 柯学 张敦宇 付坚 钟巧芳 肖素勤 王波 程在全

摘要：【目的】明確云南地方稻资源的籼粳属性及籼粳基因频率与表型性状间的相关性，为有效利用云南地方稻资源改良水稻品种提供理论依据。【方法】利用39对InDel籼粳特异性标记对来自云南12个地州69个县区的406份云南地方稻资源进行籼粳属性分析，通过计算云南地方稻资源在39个InDel位点上的籼粳基因频率，确定其籼粳类型;并对倒伏性、芒长、颖尖色、谷粒形状、株高、穗颈长、穗长、有效穗数、剑叶长、剑叶宽、每穗总粒数、每穗实粒数、一次枝梗数、二次枝梗数、千粒重、结实率、谷粒长和谷粒宽等18个表型性状进行调查，分析籼粳基因频率与表型性状的相关性。【结果】406份云南地方稻资源中有303份籼型稻（典型籼稻、籼稻和偏籼），占74.63%，其中典型籼稻77份、籼稻214份、偏籼12份;中间型资源11份，占2.71%;粳型稻（典型粳稻、粳稻和偏粳）有92份，占22.66%，其中典型粳稻36份、粳稻54份、偏粳2份。籼粳基因频率与表型性状的相关分析结果表明，粳型基因频率与穗颈长、谷粒宽、芒长、穎尖色、穗长、剑叶长、每穗总粒数、一次枝梗数、二次枝梗数、谷粒长和谷粒形状等11个表型性状呈极显著相关（P<0.01，下同），其中与谷粒宽（r=0.374）的正相关性最高，与谷粒形状（r=-0.429）的负相关性最高。【结论】云南地方稻资源存在明显的籼粳分化，InDel分子指数法所划分的7种籼粳类型在406份资源中均有出现，且其籼粳属性的分化与多个表型性状存在极显著相关性，尤其与谷粒宽（极显著正相关）和谷粒形状（极显著负相关）的相关性最高。因此，利用云南地方稻资源进行籼、粳稻定向改良及选育时应综合考虑谷粒宽和谷粒形状2个表型性状。

关键词： 云南地方稻;籼粳属性;籼粳基因频率;表型性状;InDel分子标记

Abstract：【Objective】To clarify the indica-japonica attribute of Yunnan rice landraces and the correlation between the gene frequencies of indica-japonica with phenotypic traits. It provided a theoretical basis for the effective utilization of Yunnan rice landraces to improve rice varieties. 【Method】Based on 39 pairs of indica-japonica specific markers， the indica-japonica attribute of 406 Yunnan rice landraces from 69 counties in 12 prefectures of Yunnan were analyzed.  By calculating the frequencies of indica-japonica genes in 39 InDel loci of Yunnan rice landraces， the indica-japonica types of 406 Yunnan rice landraces were determined. The lodging degree， awn length， glume colour， grain shape， plant height， panicle neck length， panicle length， panicles per plant， flag leaf length， flag leaf width， grain number per panicle， filled grain number per panicle， number of first panicle branch， number of secondary panicle branch， thousand seeds weight， seed setting rate， grain length and grain width of 406 Yunnan rice landraces were investigated. The correlation between indica-japonica gene frequencies and phenotypic traits in 406 Yunnan rice landraces were analyzed. 【Result】Among 406 rice landraces in Yunnan， 303 were indica type rice（typical indica， indica and indicaclinous）， accounting for 74.63%， of which 77 were typical indica rice， 214 were indica rice and 12 were indicaclinous rice; 11 were Intermediate type， accounting for 2.71%. 92 were japonica type rice（typical japonica， japonica and japonicaclinous）， accounting for 22.66%， of which 36 were typical japonica rice， 54 were japonica rice， 2 were japonicaclinous rice. The correlation analysis between the gene frequencies of indica-japonica and phenotypic traits showed that the gene frequencies of japonica had extremely significant correlation with panicle neck length， grain width， awn length， glume colour， panicle length， flag leaf length， grain number per panicle， number of first panicle branch， number of secondary panicle branch， grain length and grain shape（P<0.01，the same below）. The positive correlation between the gene frequencies of japonica and grain width（r=0.374） was the largest， and so was the negative correlation between the gene frequencies of japonica and grain shape（r=-0.429）.【Conclusion】The differentiation of indica-japonica in Yunnan rice landraces is obvious. All of the 7 indica-japonica types classified by InDel molecular index appear in 406 Yunnan rice landraces. The differentiation of indica-japonica attributes of rice landraces in Yunnan has  extremely significant correlation with multiple phenotypic traits， especially the highest correlation with the grain width（extremely significant positive correlation） and the grain shape（extremely significant negative correlation）. Therefore， when using Yunnan rice landraces for indica-japonica directed improvement and bree-ding， grain width and grain traits should be comprehensively considered.

Key words： Yunnan rice landraces; indica-japonica attribute; gene frequencies of indica-japonica; phenotypic trait; InDel markerFoundation item：National Key Research and Development Program（2017YFD0100202）; Yunnan Major Science and Technology Project（2018ZG005）; Joint Project of Basic Agricultural Research in Yunnan[2017FG001（-023）]

0 引言

【研究意义】亚洲栽培稻在自然和人工双重选择作用下，经过长期栽培和不断驯化，产生一系列形态、生理生化及基因上的遗传多样性，并形成2个适应不同海拔、纬度和农业生态环境的公认栽培稻亚种——籼稻和粳稻（邹文广，2011;陈萍萍等，2017）。籼稻与粳稻杂交产生的杂种优势在我国水稻生产中发挥了重要作用，是培育优质、高产水稻品种的重要途径之一（夏士健等，2011）。云南是我国也是世界公认的稻种资源多样性分布中心之一，拥有包括疣粒野生稻、药用野生稻和普通野生稻在内的3种野生稻资源、籼稻和粳稻2个栽培稻亚种及六大生态群，是我国优异地方稻种资源的富集地（曾亚文等，2001;汤翠凤等，2018）。云南地方稻资源具有丰富的遗传多样性，是水稻育种和农业生产的宝贵资源，也是确保粮食生产可持续发展的物质基础;而通过对云南地方稻资源进行籼粳属性鉴定，并结合其表型性状可为水稻品种改良及新品种选育提供重要参考依据。【前人研究进展】充分了解育种亲本的籼粳属性背景是育种家正确、合理进行杂交组合亲本选配的前提和基础。传统上鉴定栽培稻籼粳属性的方法主要是在Kato等（1928）、Oka（1958）鉴定籼粳属性的基础上，由程侃声等（1988）以稃毛、酚反应、1～2穗节长、抽穗时壳色、叶毛及粒形等6个形态指标建立并被广泛应用的程式指数法。基于形态学而形成的籼粳分类方法一直存在对偏籼和偏粳等非典型籼、粳稻类型难以准确划分的问题，表型形态是内部基因和外部环境共同作用下的综合表现，且同一栽培稻品种在不同纬度、海拔及生态环境下其表观形态也存在差异，进而影响基于栽培稻形态学籼粳鉴定法的准确性（徐建欣等，2012）。粳稻品种日本晴和籼稻品种9311全基因组测序的完成，为基于InDel分子标记的籼粳分类方法建立提供了重要工具。王林友等（2013）通过InDel分子指数法对全国各地育种上常用的48份籼稻、粳稻及中间型材料进行籼粳属性鉴定，并利用程式指数法对InDel分子标记籼粳分类的准确性进行验证，结果表明，两种籼粳属性鉴定方法的一致性高达89.58%，且在鉴定具有复杂遗传背景的中间型材料时InDel分子指数法准确性更高，证明了InDel分子标记在栽培稻籼粳属性鉴定上的可行性。Lu等（2009）从已报道的籼、粳InDel差异位点（Shen et al.，2004）中选择45对籼、粳InDel差异位点标记用于对已知籼粳属性的44个栽培稻材料及部分野生稻资源进行籼粳属性检验，结果表明，InDel分子标记不仅能准确稳定地对栽培稻的籼粳属性进行分类，在野生稻籼粳属性鉴定方面也具有很高的应用价值。云南地方稻资源的遗传背景复杂，至今已有许多学者从表型性状上开展种质资源多样性研究，发现云南地方稻资源的遗传多样性丰富且具有极高的利用价值（李自超等，2001;徐福荣等，2010;汤翠凤等，2018）。【本研究切入点】随着水稻籼粳鉴定技术的不断完善，目前针对云南地方稻资源的籼粳鉴定研究工作已取得长足进展，但主要集中在某一类型资源的籼粳鉴定，如光壳稻（曾亚文等，2000）、糯稻（王明军等，2010;杨慧等，2010）和陆稻（徐建欣等，2012），或仅对较少数量及部分地区资源的籼粳鉴定（刘克德等，1995），其研究结果具有一定局限性，尚未对云南地方稻资源的籼粳分化水平及籼粳基因频率与表型性状的相关性进行深入研究。【拟解决的关键问题】利用39对InDel籼粳特异性标记对来自云南省12个地州69个县区的406份地方稻资源进行籼粳属性鉴定，并调查其18个表型性状，分析籼粳基因频率与表型性状间的相关性，为有效合理利用云南地方稻资源改良水稻品种提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试云南地方稻资源来自云南12个地州69个县区，包括普洱市6个县区的65份，西双版纳州4个县区的27份，德宏州5个县区的25份，临沧市9个县区的88份，文山州3个县区的22份，红河州8个县区的57份，昆明市5个县区的9份，曲靖市7个县区的20份，大理州7个县区的17份，楚雄州5个县区的10份，保山市5个县区的35份，玉溪市5个县区的31份，共406份，均由云南省作物种质资源库提供，以日本晴和9311作为典型粳稻和典型籼稻的对照品种。

1. 2 表型性状调查

2019年2月，在云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所元江基地种植供试材料，每份材料单株种植4行，每行10株，行株距为15 cm×25 cm，田间管理同常规水稻大田生产。按照韩龙植（2006）的考察评价标准对406份云南地方稻资源的18个表型性状进行调查，每份材料选取中间行且生长一致的5株，调查倒伏性（Lodging degree，LD）、芒长（Awn length，AL）、颖尖色（Glume colour，GC）和谷粒形状（Grain shape，GS）等4个质量性状及株高（Plant height，PH）、穗颈长（Panicle neck length，PNL）、穗长（Panicle length，PL）、有效穗数（Panicles number per plant，PNP）、剑叶长（Flag leaf length，FLL）、剑叶宽（Flag leaf width，FLW）、每穗总粒数（Grain number per panicle，GNP）、每穗实粒数（Filled grain number per panicle，FGNP）、一次枝梗数（Number of first panicle branch，NFPB）、二次枝梗数（Number of secondary panicle branch，NSPB）、千粒重（Thousand seeds weight，TSW）、结实率（Seed setting rate，SSR）、谷粒長（Grain length，GL）和谷粒宽（Grain width，GW）等14个数量性状。

1. 3 InDel籼粳属性鉴定

1. 3. 1 水稻基因组DNA提取 2019年4月，采集406份云南地方稻资源单株的剑叶叶片置于牛皮纸袋中，40 ℃烘箱烘干保存。用美国Axygen公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取云南地方稻和对照日本晴、9311的基因组DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测DNA纯度和浓度，并将浓度统一稀释至30 ng/μL，-20 ℃保存备用。

1. 3. 2 PCR扩增及检测 InDel引物参照Shen等（2004）、Lu等（2009）基于典型粳稻日本晴和典型籼稻9311全基因组DNA序列比对获得的45对InDel分子标记，选取30份不同来源且表型性状差异明显的地方稻资源进行InDel分子标记筛选，最终选出39对覆盖水稻12条染色体且在30份表型差异地方稻资源中均能扩增出与对照品种带型一致的InDel分子标记（表1），委托上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR反应体系及扩增程序参照陈越等（2019）的方法，扩增产物用4.0%琼脂糖凝胶进行分离，经核酸染料染色后在紫外灯下用BioRAD凝胶成像仪拍摄，并分析电泳结果。对于未出现电泳条带的DNA材料重新进行PCR扩增，重复3次仍未出现则作缺失条带处理。

1. 4 统计分析

根据InDel分子标记扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果，以日本晴和9311的扩增条带为标准，在每个InDel位点上，条带位置与粳稻日本晴一致的为纯合粳稻基因型，以JJ表示;与籼稻9311一致的为纯合籼稻基因型，以II表示;条带位置既与籼稻9311一致又与粳稻日本晴一致，为籼—粳杂合基因型，以IJ表示。参照Lu等（2009）的方法，计算406份云南地方稻资源的籼型或粳型基因频率，根据表2中的籼粳属性分类标准对云南地方稻资源的籼粳类型进行划分。所调查406份云南地方稻资源的表型性状使用Excel 2016计算其均值、标准差、方差和变异系数，并以SPSS 20.0进行相关分析。

2 结果与分析

2. 1 云南地方稻资源的籼粳属性分析结果

筛选出的39对InDel分子标记在扩增云南地方稻时带型分化明显，从406份云南地方稻资源中可扩增出与日本晴条带位置吻合的纯合粳稻带型、与9311条带位置吻合的纯合籼稻带型，以及同时出现2条分别与日本晴和9311带型吻合的籼粳杂合带型，说明这39对InDel分子标记具有较强的籼粳特异性，部分云南地方稻资源的扩增结果见图1。根据对照日本晴和9311的带型计算每份资源的籼粳基因频率，并参照表2对其进行籼粳属性划分，结果表明，在406份云南地方稻资源中，有典型粳稻36份，占8.87%;粳稻54份，占13.30%;偏粳2份，占0.49%;中间型资源11份，占2.71%;偏籼12份，占2.96%;籼稻214份，占52.71%;典型籼稻77份，占18.97%。因此，所鉴定的云南地方稻资源中有92份粳型基因频率>0.60的粳型稻（典型粳稻、粳稻和偏粳），占22.66%;303份籼型基因频率>0.60的籼型稻（典型籼稻、籼稻和偏籼），占74.63%。

2. 2 云南地方稻资源在地理上的籼粳分布情况

以地州为单位，统计406份云南地方稻资源籼粳类型在不同地州的分布情况。由图2和表3可看出，曲靖市和昆明市的地方稻资源以粳型基因频率≥0.75的粳型稻为主，其中曲靖市的典型粳稻（4份）和粳稻（8份），分别占曲靖市鉴定资源总数的20.00%和40.00%，昆明市的典型粳稻（2份）和粳稻（3份），分别占昆明市鉴定资源总数的22.22%和33.33%;其他10个地州的地方稻资源均以籼型基因频率为0.75～0.89的籼稻为主。由406份云南地方稻资源7种籼粳类型在12个地州的数量分布及所占比例（表3）可看出，大多数地州收集到的地方稻为籼型基因频率>0.60的籼型稻资源，其中，楚雄州（100.00%）、玉溪市（93.55%）及西双版纳州（92.31%）地方稻资源中籼型稻数量占本地州鉴定资源的比例较高，而曲靖市（60.00%）和昆明市（55.55%）所收集的粳型稻数量占本地州鉴定资源的比例相对于其他地州更高。

2. 3 云南地方稻资源表型性状的变异分析结果

2. 3. 1 质量性状表型频率分布情况 406份云南地方稻资源的倒伏性、芒长、颖尖色及谷粒形状表型频率分布情况如图3所示。在倒伏性调查中，有329份地方稻资源表现为直，占81.03%;表现为倒的地方稻资源33份，占8.13%，中间型（20份）和斜（16份）的地方稻资源分别占4.90%和3.94%。对于芒长而言，以无芒（356份）的地方稻资源为主，占87.68%;表现为短芒（24份）、中芒（13份）、长芒（9份）的地方稻资源分别占5.91%、3.20%和2.22%，僅有4份地方稻资源为极长芒，占0.99%。在颖尖色方面，以秆黄色（272份）为主，占67.00%;表现为褐色（57份）、红色（37份）和紫色（31份）的地方稻资源分别占14.04%、9.11%和7.64%，颖尖色为黑色（9份）的地方稻资源最少，仅占2.22%。对于谷粒形状而言，以椭圆形（281份）的地方稻资源数量最多，占69.21%;其次为阔卵形（65份）和中长形（34份），分别占16.01%和8.37%;表现为短圆形和细长形的地方稻资源均有13份，占3.20%。从以上4个质量性状的频率分布情况（图3）可看出，云南地方稻资源质量性状的遗传变异较丰富，4个质量性状的所有变异类型在406份资源中均有存在。

2. 3. 2 数量性状表型变异情况 由表4可知，406份云南地方稻资源的14个数量性状存在不同程度的变异，其中穗颈长（62.85%）、二次枝梗数（42.80%）、有效穗数（38.80%）、每穗实粒数（36.54%）和每穗总粒数（31.70%）的变异系数均在30.00%以上，高于其余9个数量性状的变异系数（10.34%～26.29%），而谷粒长的变异系数（10.34%）最小。所调查14个表型性状的变异系数均在10.00%以上，表明406份云南地方稻资源14个数量性状的变异较大，具有极其丰富的表型多样性。

2. 4 云南地方稻资源粳型基因频率与表型性状的相关分析结果

以406份云南地方稻资源的粳型基因频率与18个表型性状进行相关分析，结果（表5）表明，在籼粳属性方面，粳型基因频率与穗颈长、谷粒宽、芒长和颖尖色等4个表型性状呈极显著正相关（P<0.01，下同），与穗长、剑叶长、每穗总粒数、一次枝梗数、二次枝梗数、谷粒长和谷粒形状等7个表型性状呈极显著负相关，其中与谷粒宽（r=0.374）的正相关性最高，与谷粒形状（r=-0.429）的负相关性最高，说明云南地方稻资源的籼粳属性与这两个表型性状密切相关，在定向选育籼型、粳型水稻材料时应综合考虑谷粒宽和谷粒形状。

3 讨论

3. 1 云南地方稻资源籼粳属性及其与地理分布的关系

栽培稻籼粳分化是一个复杂而连续的过程，在其分化过程中不仅产生典型的籼稻和粳稻，还出现大量渗入亚种片段的偏籼、偏粳及中间类型。近年来，基于分子标记技术开展了大量针对栽培稻籼粳属性的分类研究工作。针对栽培稻籼粳特异性差异建立的InDel分子标记可精确计算该品种的籼粳基因频率，且其PCR扩增产物带型简单、条带清晰，采用琼脂糖电泳即可获得与聚丙烯酰胺凝胶电泳相同的区分效果，有效降低了试验成本和缩短了试验周期，在籼粳属性鉴定方面具有广阔的应用前景（姚国新和黄文超，2013;赵小燕等，2015）。王明军等（2010）用34对InDel籼粳特异性分子标记对181份来自云南7个州市17个县区的糯稻资源籼粳属性进行鉴定，结果表明云南糯稻资源遗传分化明显，181份资源中包括典型粳稻、粳稻、偏粳、偏籼、籼稻及典型籼稻等6种籼粳类型。赵小燕等（2015）对浙江省农业科学院自育的不育系浙粳4A、22个恢复系及其组合的InDel籼粳属性进行鉴定，结果表明InDel分子标记在水稻籼粳属性分析方面具有较高的准确度和灵敏度。李小湘等（2019）通过38对InDel引物分别对1982、2008和2017年保存于广东野生稻资源圃里的江永普通野生稻籼粳性进行分析，结果表明大部分江永普通野生稻为粳稻，且随着时间推移籼型基因频率不断提高。本研究利用39对InDel分子标记对云南地方稻资源进行籼粳属性鉴定，结果表明，来自云南12个地州69个县区的406份地方稻资源有303份籼型稻（典型籼稻、籼稻和偏籼），占74.63%，其中典型籼稻77份、籼稻214份、偏籼12份;粳型稻（典型粳稻、粳稻和偏粳）有92份，占22.66%，其中典型粳稻36份、粳稻54份、偏粳2份;中间型资源有11份，占2.71%。可见，406份云南地方稻资源籼粳分化明显，InDel分子指数法所划分栽培稻的7种籼粳类型均有出现。

在地理分布上，籼稻主要分布于熱带和亚热带的低纬度低海拔地区，而粳稻主要分布于高纬度低海拔及低纬度高海拔地区（王明军等，2010;徐建欣等，2017）。本研究鉴定的406份云南地方稻资源以籼型基因频率>0.60的籼型稻为主，可能是本研究检测的地方稻资源多收集于云南南部低纬度地区，而被鉴定为粳型稻的资源大多收集于云南高海拔地区。以地州为单位进行分析发现，除曲靖市和昆明市外，其他地州收集的资源均以籼型稻为主，其中楚雄州、玉溪市和西双版纳州地方稻资源中籼型稻数量占本地州所收集资源的比例明显高于其他地州，分别为100.00%、93.55%和92.31%;而曲靖市和昆明市鉴定出粳型稻的数量占本地州资源总数的比例明显高于其他地州，分别为60.00%和55.55%。这除了与纬度、海拔和温度等因素有关外，可能还与当地农民的换种行为及农业部门的频繁引种有关。

3. 2 云南地方稻资源籼粳基因频率与表型性状的相关性

近年来，利用InDel分子标记鉴定水稻籼粳属性并进行遗传多样性的研究越来越多，但对籼粳基因频率与表型性状进行相关分析的研究较少。为更好地了解云南地方稻资源籼粳基因频率与各表型性状间的相关性，本研究将云南地方稻资源的粳型基因频率与18个表型性状进行相关分析，结果表明，云南地方稻资源的粳型基因频率与12个表型性状存在显著或极显著相关，其中粳型基因频率与谷粒宽和谷粒形状的相关性最高且达极显著水平，对应的相关系数分别为0.374和-0.429。此外，在所调查的18个表型性状中，株高、穗长、剑叶长、剑叶宽、每穗总粒数及一次枝梗数等6个表型性状不仅与粳型基因频率紧密相关，还与其他表型性状存在显著或极显著的相关性，说明云南地方稻资源籼粳属性与表型性状间存在高度的相关性。

4 结论

云南地方稻资源存在明显的籼粳分化，InDel分子指数法所划分的7种籼粳类型在406份资源中均有出现，且其籼粳属性的分化与多个表型性状具有显著或极显著相关性，尤其与谷粒宽（极显著正相关）和谷粒形状（极显著负相关）的相关性最高。因此，利用云南地方稻资源进行籼、粳稻定向改良和选育时应综合考虑谷粒宽和谷粒形状2个表型性状。

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（责任编辑 兰宗宝）