基于高通量测序技术研究页岩气区上方微生物多样性

顾 磊，许科伟，汤玉平，杨 帆，王国建，杜 伟，高 波，腾格尔,3

(1.中国石化 石油勘探开发研究院 无锡石油地质研究所，无锡 214126；2.中国石化 石油勘探开发研究院 非常规资源研究所，北京 100083；3.中国地质调查局 油气资源调查中心，北京 100083)

油气微生物勘探技术是研究下伏油气藏中渗漏轻烃与土壤中油气微生物富集度相关性的技术，属于地表勘探法的一个分支[1]。经过多年的研究，油气微生物勘探技术不断发展，逐渐形成了经济有效且多解性小的特点，受到油气勘探领域研究人员的重视[2-6]。

在下伏油气藏压力驱动的存在下，轻烃类气态物质能够持续地垂向扩散运移，土壤中有一类微生物能够以这类轻烃作为碳源进行生长，同时却有碳源专一性，这类微生物被称为油气微生物[7-8]。以油气微生物为目标的勘探方法，可以运用于勘探初期的有利富集区预测，从而降低勘探风险，并且经济有效。在成熟勘探区，该技术能通过烃类组构和含烃量将地震勘探查明的地质构造划分成不同级别，表征油藏开发地区油、气、水的分布[9]。值得注意的是，微生物的生长发育除以从地下渗漏的微量轻烃作为碳源外，还受到周围环境的影响，如上浮烃类浓度、地表植被、土壤类型、气候、土壤湿度、供氧、Eh/pH值、盐度或其中的关键离子、营养物质、环境扰动等。若微生物发育的相对强弱是由环境因素所引起，必定会造成油气富集或贫乏的假象。因此对于不同环境地区的微生物多样性研究就尤为重要，能够帮助研究者加深该地区油气微生物生态特征的认识。

目前主流的油气微生物勘探技术仍然采用的是传统培养计数法CFU (Colony-forming units) ，即把整个土壤微生物群落视作“黑箱”，通过一段时间的充气培养后，比较油气区和背景区之间上述两类微生物数量和活性的差异。培养法存在的问题是，实验室条件很难模拟自然环境，导致只有部分微生物被检测，低估其数量。随着生物信息学与分子生物学近十年的迅速进步，解析能力已经能够初步满足地质生态系统中油气微生物群落演替规律研究的要求，由原有的宏观细胞数量水平的研究进步到微观微生物群落组构的角度来描述目标油气指示微生物的变化，结合微生物生态学大数据系统地研究地质微生物，必将是油气微生物勘探技术的未来发展方向。系统研究地质微生物生态学，必须基于高通量测序技术(High-Throughput Sequencing)来获取微生物群落的基因水平信息。高通量测序技术是一种对生物焦磷酸序列进行超高通量测序的系统，同时具备定量的能力[10-12]。

本文中使用高通量测序分析技术对微生物基因组即高度保守又特异性变化V3、V4区进行测序分析，此技术可以在复杂的环境样本中更为精确地分辨目标菌的类、群分布特征及独特的群落指纹，为油气微生物原位勘探奠定基础[13-19]。

本文的主要研究区为丁山地区，构造上处于四川盆地川东南构造区，主要表现为向北西陡倾、向南东抬升、被齐岳山断裂带所切割的鼻状构造。目前该地区钻井有深层(丁页2井、丁页5井)，也有中浅层(丁页3井、丁页1井)，同时具备超压与常压条件，地质条件相对统一，从研究者样本角度分析，是一个可以从近地表角度进行页岩气滞留/散失解析的优秀范本。因此，为了更好地了解丁山地区页岩气富集地区土壤微生物种群组成，本文通过高通量测序技术，研究了丁山地区与具有相同页岩富集条件的焦石坝部分地区的样本，对油气微生物的含量进行鉴定，初步解析了该地区油气微生物分布特征。

1 材料与方法

1.1 土壤样品采集

丁山地区部署SS’号剖面长度约60 km(图1a)，样品间隔500 m，共5口井，每口井4个物理点；焦石坝地区部署穿过焦页4、焦页9的EE’号联井剖面(图1b)，长度约35 km，样品间隔500 m，2口井位，每口井4个物理点，共计218个物理点。采样过程中为保证样品不受其他微生物干扰，将60 cm深度的土样采集离地面后快速装入伽马射线辐射的无菌密封袋中，冷藏保存并运输至实验室进行后续实验。

图1 川东南丁山和焦石坝剖面样品采集部署

1.2 土壤总DNA提取

将冷冻保藏的新鲜土壤样品使用FastDNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals，Santa Ana，CA)试剂盒进行提取，步骤参照试剂盒说明书进行。

1.3 高通量测序

基于总DNA扩增细菌16S rRNA的V4-V5区基因片段，扩增引物使用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′)与907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)，设计特异的7 bp Barcode 序列用于区分样品。扩增的反应条件为：94 ℃，5 min；30×(94 ℃，45 s；55 ℃，45 s；72 ℃，1 min)；72 ℃，10 min。PCR产物通过胶回收纯化和定量后可进行测序。测序平台使用Illumina HiSeq，利用双末端测序(Paired-End)构建小片段文库。测序数据Reads拼接过滤，并OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类，用于下一步物种注释及丰度分析。

1.4 土壤微生物高通量测序信息分析

测序结果的信息分析进行了如下的信息学解析：OTUs聚类进行物种注释，针对丁山和焦石坝地区的微生物样本进行训练集获取，解析好氧甲烷氧化菌种群多样性异常特征，提供好氧甲烷氧化菌丰度上的多样性特征。所有样品拼接过滤后的Clean Tags 进行聚类(选取相似性为 97%)生成OTUs，同时去除 Singleton OTU 及嵌合体，计算各物种的相对丰度，同时选取相对丰度在1%上的物种进行分析研究；运用Alpha Diversity分析(Alpha 多样性)进行样品内微生物群落丰富度和多样性解析。使用的实验分析方法均参照标准高通量测序信息分析方法进行[20]。

1.5 热释烃检测

将土壤样品通过100～220 ℃高温与真空处理后，释放出土壤颗粒吸附的气态轻烃(通常为C1—C5烃类)，使用气相色谱仪检测获得烃类信息。

2 结果与分析

2.1 丁山与焦石坝地区油气微生物优势群落解析

通过OTUs聚类注释后即可进行区域性群落差异的解析(图2)，其中D1—D30为丁山地区页岩气区样品，J1—J20为焦石坝页岩气区样品，NTC1—NTC8为背景无气区样品。丁山地区微生物Amycolatopsis属占5.08%、Streptomyces属微生物占9.83%。Streptomyces属作为油气敏感性菌株，从物种的相对丰度来看在丁山地区含量较高，可能与该地区轻烃含量高于背景地区有关。Amycolatopsis属含量较高，其属下的微生物与丙烯的产生有关。丁山地区主要的甲烷氧化菌为Methylotenera，属于Ⅰ型甲烷氧化菌，其相对丰度为1.6%。焦石坝地区，微生物Amycolatopsis属占4.17%，KSA1属丰度为4.09%，它与红球菌Rhodococcus属相似性较高，为碳数2～4具有烃降解能力的革兰氏阳性菌。其中丁烷氧化菌Pseudomonas属丰度为1.4%。Marinobacter属丰度为15.58%，Marinobacter是海水中变形菌属，可以降解碳氢化合物，其属下的一些菌株和物种可降解烃类。

获得OTU丰度矩阵之后，可以进行一系列的分析，根据辛普森指数物种丰度、Shannon指数可以计算每个样本群落的Alpha多样性(图3)。丁山与焦石坝页岩富集区域内有比背景地区更高的物种丰度。在丁山页岩气区域D1、D2、D3、D4的Specie Rank值可达到1 000以上，比背景区的均匀度更好。页岩气区边界D12区域的物种数为825，也高于非背景区的最高物种数量801。背景区域的微生物种类数量为531，页岩气边界区域、页岩气上方的平均物种数分别为523、1 461，物种在页岩气上方的丰度较高。页岩气区域边界的物种多样性为801，与背景区基本相似，但是Shannon指数6.963 909比背景区域3.386 068更高，说明页岩气区域的物种均匀度更高，在页岩气区域具有较好的优势物种。

2.2 丁山与焦石坝地区油气微生物群落差异性分析

丁山与焦石坝地区物种属水平丰度聚热图用于表示丁山组气区上方、焦石坝组气区上方和空白对照背景组样品在属水平上的群落组成和丰度，选取关注的油气指示微生物及其在每个样品中的丰度信息绘制热图，如图4所示为排名前54的属水平具有pmoA、alkB等烃类降解氧化相关基因物种丰度热图。通过细致比较热图(双序图，图4)后，发现这些样品聚类特征十分明显，丁山地区4个样品中甲基类微生物，都分布在一簇，相对于其他类型菌均具有较高的丰度，丁山页岩气区上方点D1、D3、D4与D2在甲基叠球菌(Methylosarcina)相关类别上有丰度的差异，优势种分别为甲基嗜氧反硝化菌(Methylophilales)、甲基孢囊菌(Methylocystis)。

图2 川东南丁山与焦石坝地区页岩富集区微生物属水平物种的相对丰度

图3 川东南丁山与焦石坝地区页岩富集区物种Rank-Abundance 曲线

图4 川东南丁山与焦石坝地区物种属水平丰度聚热图

然而，焦石坝地区甲基类微生物甲基叠球菌、甲基嗜氧反硝化菌、甲基孢囊菌等甲基类生物同样高丰度聚簇，同时其他短链烃降解氧化能力的菌同样具有较高的丰度，例如诺卡氏菌(Nocardia)、类诺卡氏菌(Nocardioides)、红螺菌(Rhodospirillum)等。

从敏感性种属角度来看，图4显示的高丰度菌属，这些微生物从属的生物科如甲基杆菌(Methy-lobacter)、甲基球菌(Methylococcus)、嗜甲基菌(Methylophilaceae)和红螺菌等，可能具有很强的油气资源指示意义。其中，甲基杆菌和甲基球菌已被证明具有气态烃氧化功能，在已知国内一些油气藏上方也发现了上述两类细菌的大量分布。嗜甲基菌已在巴西陆上油气藏上方被确认为油气敏感菌，常在油气泄漏点与运输管道周围土壤中被检测到。红螺菌则与石油污染土壤、含有废水和污泥有关。此外，还存在一些对烃类极其敏感的微生物，如Acidobacteriaceae、Solimonadaceae、Thiotrichaceae等，这些与烃类负相关的微生物也值得注意。

2.3 丁山地区上方土壤中甲基类油气微生物特征

通过多样性分析后，将3种丰度较高的甲基类微生物进行剖面上的分布研究(图5)。从丁山超压、常压、逸散地区微生物指标特征上看，甲基类甲基嗜氧反硝化菌、甲基孢囊菌、甲基球菌丰度的高值异常出现在南部的逸散地区和断裂的上方，形成了相对较高而断裂陡升的异常特征，在丁页2、丁页5井所处的高埋深、超压地区异常值低于常压区。

2.4 焦石坝地区上方土壤中甲基类油气微生物特征

从焦石坝地区焦页9—焦页4联井剖面微生物指标特征上看，主要指标甲基嗜氧反硝化菌、甲基叠球菌、甲基暖菌(Methylocaldum)指标的高值异常出现在西北部和东南部的逸散地区和断裂的上方，形成了相对较高而断裂陡升的异常特征(图6)。

3 讨论

丁山构造是一个断背斜，页岩气储层由深层(丁页2井、丁页5井)至中浅层(丁页3井、丁页1井)，压力也从超压至泄压过渡。受到三叠系嘉陵江组膏盐岩盖层保存情况与构造缝发育特征双重因素控制，从西北向东南方向，由于上覆嘉陵江组膏盐岩盖层保存逐渐缺失使其封闭性受到影响，垂向逸散程度从超压区至常压区逐渐增强，常压区和泄压区嘉陵江组膏盐岩盖层剥蚀，地表甲基类微生物丰度也逐渐增强；侧向上丁页3、丁页1井地区靠近齐岳山主断裂，致使侧向运移逸散增强，地表甲基微生物丰度与丁山地区龙马溪组页岩气藏滞留—逸散特征匹配关系明显[21](图7)。

图5 川东南丁山地区上方土壤中甲基类油气微生物分布剖面SS’位置见图1a

图6 川东南焦石坝地区上方土壤中甲基类油气微生物分布剖面EE’位置见图1b

此外，丁山地区联井剖面地表热释烃甲烷指标也从地表烃类累积响应上印证了丁山地区地质逸散模式(图8)。轻烃长期渗漏或者逸散会造成近地表地球化学场的变化，除了游离态轻烃外还存在被土壤颗粒吸附或包裹的吸附烃，这类吸附烃代表了烃类渗漏逸散的累积效应，可使用热释烃检测的方式获得。由检测结果可以看出，在齐岳山断裂上方，轻烃甲烷累积通量明显较高，而远离断裂带的轻烃甲烷浓度呈现下降趋势。从甲烷热释烃的累积情况上可以发现，该地区近地表长期受甲烷烃类的影响，作为碳源长期供给后影响了甲烷氧化类微生物的富集。这与该区块微生物指标异常强度、与区域盖层封闭性变化趋势相似。从西北往东南，与齐岳山断裂越来越近，埋藏深度减小，应力减小，裂缝发育程度增加，逸散强度增强。所不同的是，微生物指标反映的是地表受烃类影响的地球化学生态场的情况，更能准确反映页岩气中烃类甲烷渗漏至地表的实时动态，而热释烃指标所反映甲烷轻烃渗漏至地表的变化情况具有一定的滞后性，但从整个趋势上观察，是相互印证的。

在焦石坝地区发现甲基微生物丰度在焦石坝高压保存条件良好地区丰度低于两端常压地区，与保存条件呈负相关。侧向上焦页4井往东南靠近主断裂，致使侧向运移逸散增强，地表甲基微生物丰度与龙马溪组下段—五峰组地震预测显示的保存与逸散特征对应良好。丁山页岩气区、焦石坝页岩气区与背景区对比显示，2个气区上方点群落基因组成并不类似，并且都跟背景点表现出很大的类别性差异。丁山地区以甲烷氧化甲基类菌为主，在焦石坝地区C3以上烃气降解氧化菌丰度相较于背景地区也较高，推测受二叠系及以上层位油气藏累积效应干扰，目前已查明焦石坝地区存在二叠系茅口组天然气与龙马溪组页岩气形成了叠加效应，增加了地表除甲烷轻烃以外的C3烃类累积[22]。然而，由于焦石坝位于四川盆地川东南地区，储集层较为复杂，包含多套油气系统，垂向上形成了叠加，对于烃类垂向渗漏逸散情况较为复杂，储层中的碳酸盐岩、碎屑岩的特殊性，使得勘探面临隐蔽性、复杂性高的挑战[23]。本文在焦石坝与丁山地区的近地表油气微生物响应情况也反映出了复杂性。对于焦石坝地区所展现的C3以上烃气降解氧化菌丰度异常与地下油气累积效应的相关性研究，还需在地质情况深入解析的基础上进行。因此，目前在该地区储集机理尚未明确的情况下，只能单独采用近地表指标的研究进行探索与辅助探讨。

图7 川东南丁山地区页岩气逸散模式[21]

图8 川东南丁山地区联井剖面热释烃甲烷浓度分布剖面SS’位置见图1a

4 结论

(1)通过最先进高通量测序技术的应用，在减少成本的情况下短时间内获得了大量的基于独立OTU的分析信息，这也是首次将高通量测序技术应用于川东南丁山地区进行油气微生物特征分析。对样品内的丰富度、均匀度进行了多样性分析，结果表明页岩气富集环境土壤中的微生物数量明显高于非油气环境，表明页岩气富集环境蕴含了丰富的油气细菌菌种资源。

(2)从丁山地区与焦石坝地区前54的物种属水平丰度聚热图可以发现，油气指示类微生物与油气资源类型密切相关，所测得微生物异常区处于断层交汇区，裂缝发育部位和断裂带附近。依据甲基类微生物异常区域主要位于断裂带及附近、裂缝发育、盖层缺失的区域，初步推测了与丁山地区页岩气逸散模式的关系，值得进一步进行研究验证。

(3)高通量测序也存在着一些问题，测序速度提高了，但后续的海量测序数据的分析是一个难题，针对海量数据的筛选是研究结论可靠性的关键，随着高通量测序成本的进一步降低和对海量数据处理能力的不断提高，高通量测序将成为一项常规的实验手段。