陕西不同地区马铃薯腐烂茎线虫的分离鉴定及同源性分析

刘 晨，杨艺炜，王家哲，常 青，洪 波，张 锋

(陕西省生物农业研究所，西安 710043)

马铃薯俗称土豆，作为全球第四大粮食作物在农业生产中具有举足轻重的地位[1]。但中国马铃薯产业一直饱受病害困扰，马铃薯病害严重制约国内马铃薯单位面积产量的提升以及马铃薯产业的进一步发展，目前陕西省马铃薯产业面临着同样问题。甘薯已经成为中国许多省(区)调整农业产业结构，促进农村产业发展的重要作物，甘薯在陕西省也逐步成为重要经济作物，对于带动区域农业经济发展具有重要意义。马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchusdestructor)也被称为Potato nematode，最初发现于马铃薯上，是其贮藏期一种重要病害[2]，也是严重为害马铃薯的重要病原之一[3]。在中国，马铃薯腐烂茎线虫首次在甘薯上被分离出来，发生严重时可造成80%以上的减产，甚至绝收[4-5]。此外，腐烂茎线虫还可为害蚕豆、小麦、当归、三七等几十种农作物及中药材[6]。

马铃薯腐烂茎线虫目前主要分为2类基因型，有文献[7]报道这2个基因型在尾长、C值、V值等形态特征值上存在显著差异。2007年，有学者[8]对多个马铃薯腐烂茎线虫种群的核糖体ITS区序列进行比对，发现在中国不同地理种群明显分为2个生物型，即A型和B型这两种。此外，还有多篇文献也证实马铃薯腐烂茎线虫种群中存在2类基因型这一结论[9-11]。有国外学者将不同寄主作物上的马铃薯腐烂茎线虫群体分为A型、B型、C型、D型、E型、F型和G型这7个不同生物型[12-13]。A型仅在中国发现，且只为害甘薯，B型和E型主要为害甘薯和马铃薯，C型寄主为马铃薯、甘薯及大蒜，D型可侵染大蒜，F型在甘薯和黄芪上有分离出来，G型为害马铃薯。

1925年，马铃薯腐烂茎线虫首次在美国甘薯上被发现[14]，传入中国后，在北京、山东、河北等甘薯生产区均造成严重为害[15]。马铃薯腐烂茎线虫在国外主要为害马铃薯，在国内主要为害甘薯，但近几年，在甘肃等地也发现此线虫为害马铃薯[16-18]。因此，明确该病原线虫的生物型及系统发育地位，可为其致病性研究奠定基础，同时为马铃薯及甘薯生产区腐烂茎线虫的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

2018年3月至12月期间，马铃薯腐烂茎线虫采自陕西省榆林市定边县、靖边县、神木县及榆阳区的马铃薯发病田，及陕西省渭南市合阳县及兴平市的甘薯发病田。

1.2 试验方法

1.2.1 线虫的分离 将不同地区采集病薯的典型病块区切下，切成1 cm×1 cm小块，清水冲洗干净，取双层面巾纸将其包住，采用漏斗分离线虫。收集到的线虫用0.5%次氯酸钠浸泡、消毒5 min，无菌水冲洗3遍，保存，备用。

1.2.2 形态学鉴定、线虫标本制作及特征值测量 将分离得到的腐烂茎线虫悬浮液，置于65 ℃水浴处理0.5 min热力杀死[19-21]，并制成玻片以供观察。应用EZcam软件，在显微镜下对腐烂茎线虫的主要形态特征进行观察、测量及拍照。主要测量数据包括线虫的体长(L)、体宽(W)、口针长度(S)、头长(H)、尾长(T)等[22]，对比不同生物型的马铃薯腐烂茎线虫在形态上的差异。每组测量20条线虫，计算平均值。

扫描电镜观察：将线虫置于装有5%戊二醛的离心管中于4 ℃下固定3 h，在3 000 r/min下离心2 min，弃上清，留下层的线虫，用0.2 mol/L磷酸盐缓冲液进行冲洗之后，在3 000 r/min下离心2 min，弃上清，留下层的线虫，用超声波清洗仪将线虫于30 ℃条件下清洗30 min，经体积分数依次为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水，每级脱 8 min，离心2 min。再依次用乙酸异戊酯与无水乙醇体积比分别为1∶2、1∶1、2∶1、1∶0的乙酸异戊酯与无水乙醇混合液置换，每步置换6 min，离心2 min，EMITECH-K850型临界点干燥仪干燥，MSP-1S型离子溅射仪喷金镀膜，在HITACHI-3400N型扫描电子显微镜下观察并照相。

1.2.3 分子生物学鉴定提取线虫DNA 向1.5 mL离心管内加入16 μL×PCR Buffer(去Mg2+)、4 μL蛋白酶K、40 μL ddH2O，再将线虫放入混合液中；将离心管置于液氮中研磨，反复研磨3次；离心管水浴65 ℃保温90 min；再放置 85 ℃金属浴10 min，取出放至室温即可用于PCR扩增。

PCR扩增条件：反应选取腐烂茎线虫线粒体COI通用引物、核糖体ITS通用引物及A型生物型及B型生物型的特异性引物(表1)。

表1 用于鉴定马铃薯腐烂茎线虫的引物Table 1 Primers of Ditylenchus destructor

PCR反应体系为2×TaqMix 25 μL(上海生工)，20 μmol/L上游引物2 μL，20 μmol/L下游引物2 μL，DNA模板2 μL，H2O补充总体积至50 μL。PCR 扩增反应为95 ℃预变性4 min， 94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸 2 min，35个循环；72 ℃最后延伸7 min，PCR产物4 ℃保存。PCR反应结束后，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4 系统发育树构建 将PCR产物送至上海生工生物工程有限公司，进行测序(Sanger 测序)。利用MEGA 6.0软件，采用邻接法(Neighbour-Joining, NJ)分别对线粒体COⅠ及核糖体ITS序列进行系统发育树的构建。

2 结果与分析

2.1 腐烂茎线虫形态学鉴定

在40倍显微镜下观察可见，雌性腐烂茎线虫温热死亡后虫体略向腹部弯曲，虫体表角质膜上有细环纹，环距1 μm ，唇区低且平滑，稍突出于体外，头区与体躯之间有一轻微的溢缩。虫体侧宽约占整体宽的1/5 ，侧线6 条(图1)。食道属垫刃型，口针细小，长10～13 μm ，口针基球小而明显，呈圆形(图2)。中食道球卵圆形，肌肉质，具瓣门。狭部窄，其上环绕神经环。后食道腺体从背面或侧面交盖肠的前端，约交盖半个体宽至1 个体宽。后阴子宫囊明显，其长度一般为阴门到肛门距离的2/3。卵母细胞在近子宫处单行排列。后阴子宫囊长约达阴门至肛门距离的3/4 位置处。尾圆锥形，略向腹部弯，尾端细圆(图2)。

雄虫虫体前端形态与雌性虫形态相似，尾略窄，尾端细圆；交合刺略向腹部弯曲。交合伞始于交合刺前端相对应的位置，向后伸约尾长的75%，基部膨大, 其宽处有2个指状突起；引带简单且短(图2)。

2.2 不同生物型腐烂茎线虫特征值测量

对不同生物型的马铃薯腐烂茎线虫雌、雄成虫各测量20头，测量结果见表2。

A.6面辐射状唇片；B.交合伞始于交合刺前端；C.体中侧区6条侧线

A.Six radial labrum; B.Copulatory bursa begins at the front of speculum; C.Six lateral lines of middle body side

图1 马铃薯茎线虫扫描电镜照片
Fig.1 Stereoscan photograph ofDitylenchusdestructor

A.雄虫交合刺侧面及交合伞；B.交合刺腹面及指状；C.雌虫阴门及尾部；D.头部溢缩及口针；标尺：A/B/C=25 μm，D=10 μm

A.Spiculum lateral surface and copulatory bursa of male; B.Segmental venter and finger of speculum; C.Cunnus and tail of female; D.Excessive shrinkage and lancet of head; scaleplate:A/B/C=25μm，D=10μm

图2 马铃薯腐烂茎线虫显微镜下特征形态Fig.2 Characteristic morphology under microscope of Ditylenchus destructor

注：a=体长/体宽；b=体长/体前部至肠前端距离；c=体长/尾长；V=体前端至阴门距离×100/体长。

Note:a=Length/width;b=Length/distance from anterior body to anterior intestine;c=Length/Tail;V=Distance from anterior end of body to vulva×100/length.

从表2可以看出，无论B型还是A型腐烂茎线虫的雌成虫均比雄成虫体长长，体宽也略宽，合阳与兴平的A型马铃薯腐烂茎线虫雌成虫与雄成虫在体长、a值、b值、c值及V值之间差异不显著，B型腐烂茎线虫雌成虫与雄成虫的体长均比A型的显著减小，雌成虫的V值B型比A型小，但a值B型高于A型，b值、c值差异不显著。测量结果与郭全新等[19]、刘维志等[20]的测量结果基本一致。

2.3 腐烂茎线虫分子鉴定

2.3.1 不同地区茎线虫线粒体COI及核糖体ITS通用引物检测结果 通过马铃薯腐烂茎线虫的线粒体通用引物扩增陕北及关中合阳、兴平的线虫群体，从凝胶成像结果来看，所有样品都扩增出480 bp条带(图3)。用马铃薯腐烂茎线虫ITS通用引物进行PCR扩增，结果显示，为害陕北马铃薯的茎线虫均有约950 bp的条带，关中合阳、兴平甘薯上茎线虫均扩增出约760 bp的条带(图4)。因此可以确定所有这些线虫样品均为马铃薯腐烂茎线虫。

2.3.2 不同地区腐烂茎线虫生物型鉴定结果 为确定不同地区马铃薯腐烂茎线虫的生物型是否相同，选取A型与B型的特异性引物扩增陕北、合阳及兴平的马铃薯种群。从图5可以看出，榆林地区靖边县、定边县、神木县及榆阳区为B型马铃薯腐烂茎线虫，合阳县及兴平市采集的为A型马铃薯腐烂茎线虫。

图3 ITS区通用引物扩增结果Fig.3 Universal primer amplification of rDNA-ITS

2.4 rDNA-ITS序列分析及系统发育树构建

对马铃薯腐烂茎线虫核糖体ITS通用引物扩增产物测序结果在NCBI上BLAST比对后发现，陕北B型种群与登录号为JZ133363、JZ133338的B型马铃薯腐烂茎线虫群体同源性高达99.5%，关中A型种群与A型的MH992393的同源性高达99.1%。

使用腐烂茎线虫核糖体ITS通用引物对陕北不同地区、合阳及兴平的种群进行扩增及测序，利用MEGA6.0软件，将这7个序列及NCBI上已知的5个序列号为JZ133363、JZ133338的B型及MH992393的A型马铃薯腐烂茎线虫种群分别构建系统发育树(图6)。从结果来看，种群DingB、JingB、ShenM及YuY的rDNA-ITS序列与已知序列MK979365、JZ133411聚为一支。XingP、HeY和 HeY2聚在一支。合阳的两个不同样品遗传距离最近，与兴平种群亲缘性高，这3个种群均为A型马铃薯腐烂茎线虫，陕北的定边县及靖边县的种群遗传距离最近，与神木县及榆阳区的茎线虫种群亲缘性较高，这4个种群均为B型马铃薯腐烂茎线虫。同时，此系统发育树成功将A型、B型两个种群的马铃薯腐烂茎线虫成功区分开。此结果与分子鉴定结果较为一致。

图4 线粒体通用引物扩增结果Fig.4 Universal primer amplification of mtDNA

图5 A型、B型特异性引物扩增结果Fig.5 Specific primer amplification of type A and B

图6 马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS系统发育树Fig.6 Phylogenetic tree of Ditylenchus destructorrDNA-ITS

3 结论与讨论

通过对中国马铃薯腐烂茎线虫rDNA-ITS序列对比可以看出，其种群主要分为A型和B型2个基因生物型[8,23]，但关于这2个生物型群体在形态特征、寄主范围、病理学上等方面差异的研究较少[18]。本研究首次在陕西省发现该线虫为害马铃薯及甘薯，并首次对陕西不同地区、不同寄主上该线虫的生物型进行了形态学与分子生物学鉴定。结果显示，侵染陕西省榆林马铃薯的为B型马铃薯腐烂茎线虫，侵染陕西省合阳及兴平甘薯的为A型。形态特征值的测量结果显示，A型马铃薯腐烂茎线虫比B型的体长长，体宽略宽，雌成虫的V值较大，但a值B型马铃薯腐烂茎线虫高于A型，b值、c值差异不显著。不同地区相同生物型的茎线虫，在形态特征值上差异并不显著。构建系统发育树，成功将A型、B型2个种群的马铃薯腐烂茎线虫区分开。

有研究[18,23-24]表明：中国山东、河北及江苏等地甘薯上马铃薯腐烂茎线虫可分为A型、B型2个生物型；有学者[12]在此基础上将马铃薯腐烂茎线虫种群分为A-G型7个单元型，A-F单元型均在中国有发生，而G型并未发现。关于陕西省是否还存在马铃薯腐烂茎线虫的其他生物型，及不同生物型发生区域、侵染作物种类、生物特性及其他分子生物学方面是否存在差异，还需进一步调查研究，这将对有效预防及控制马铃薯腐烂茎线虫的扩散提供理论依据。