黄连提取物对TGEV的体外抑制效果

朱买勋，唐红梅，陈春林，闫志强，曹 政

(重庆市畜牧科学院，重庆荣昌 402460)

猪传染性胃肠炎(Transmissible gastroenteritis，TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus，TGEV)引起的一种接触性传染病。该病传播方式广，能通过污染的饲料、圈舍、粪便、病猪的接触等途径传播；易感动物群体多，能在各种日龄段猪群间暴发，尤其是断奶前仔猪，多以相对密集型饲养，极易形成大规模暴发；传播速度快，猪群一旦感染猪传染性胃肠炎，会经过各种途径在猪群间迅速传播，病毒在动物体内繁殖形成大规模的感染；致病性强，病毒入侵仔猪后，迅速破坏仔猪胃肠道菌群和黏膜组织结构，仔猪表现出呕吐、腹泻、脱水等临床症状，发病率高达到87.97%，病死率达到89.90%[1-2]；防治效果差，目前无特效治疗药物，主要是通过增强免疫和对症治疗的药物对猪群进行防治，严重危害养猪业的发展，2019年被世界动物卫生组织(Office international des epizooties，OIE)列为烈性传染病[3]。面对临床中TGEV致使的较大危害和经济损失，开发能够高效防治的药物是应对该问题的主要措施。根据TGEV主要寄生于宿主细胞的生物学特性，开发防治TGEV的理想药物应对病毒呈选择性抑制作用，穿入细胞并对细胞无损害作用。因此，本试验根据TGEV致使猪的临床变化，选择具有抗菌、抗病毒、抗腹泻、抗氧化、抗溃疡等作用功效的中药黄连进行提取制备成黄连提取物(Coptidis Rhizoma extract，CRE)，在朱买勋等[4-5]前期研究的连梅提取物能有效防治仔猪湿热泻痢，防治TGEV为阳性的仔猪腹泻的基础上，着力于CRE抑制TGEV增殖、保护宿主细胞、激发宿主细胞抗病毒相关因子的分泌等研究，明确CRE体外抑制TGEV的作用效果及其作用方式。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞和病毒 猪肾细胞(PK-15)，中国科学院典型培养物保藏中心提供，编号：GDC061。传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)，购于ATCC，编号：VR-763。

1.1.2 试验药物 黄连提取物(Coptidis Rhizoma extract，CRE)由黄连经过醇提，硫酸反应，盐酸沉淀，过滤，纯化结晶制备而成。测定后盐酸小檗碱含6.37%，黄连碱含3.03%，巴马汀含 0.11%。

1.1.3 主要试剂 总RNA提取试剂盒(批号：0000197548)、反转录试剂盒(批号：0000219081)、PCR Green Master Mix(批号：0000219579)、qPCR Master Mix(批号：0000213128)均购于普洛麦格生物技术有限公司，BM2000 DNA Marker(批号：716382CC)、PRMI 1640(批号：0023016)、胎牛血清(批号：1528235)均购于博迈德生物有限公司。

1.1.4 主要仪器 ABI Veriti 96梯度PRC仪，美国应用生物系统公司产品；GBOX SYDR4/2752凝胶图像分析仪，美国伯腾仪器有限公司产品；DYY-7C电泳仪，北京市六一仪器厂产品；ABI 7500荧光定量PRC仪，美国应用生物系统公司产品；Avanti J-26 XP高速离心机，美国贝克曼库尔特有限公司产品；紫外分光光度计，德国艾本德股份公司产品。

1.2 方 法

1.2.1 病毒TCID50的测定 采用 Reed-Muench法测定，将TGEV病毒液分别用细胞维持液(含2%血清的DMEM培养液)依次10倍稀释成10-1，10-2，10-3，…，10-7共7个稀释度。将各稀释度病毒悬液接种100 μL于长有单层细胞的96孔板，各设8个复孔。37 ℃、5% CO2孵育2 h后吸取出病毒液，加入细胞生长维持液液，置于5%CO2、37 ℃孵育箱培养，每天观察记录细胞病变(Cytopathic effect，CPE)，连续观察7 d，按Reed-Muench法计算病毒致半数细胞病变的滴度(TCID50)[6]。

TCID50=Anti{B+(50-小于50%抑制百分率)/(大于50%抑制百分率-小于50%抑制百分率)×C}

式中：B=lg大于50%抑制百分率；C=lg稀释倍数。

1.2.2 CRE对PK-15细胞最大无毒浓度的测定 采用MTT检测法，将细胞悬液稀释成1×105个/mL接入96孔细胞培养板，长满单层后，加入含有CRE质量浓度为10-1～10-8g/mL的维持液(血清浓度2%)，每孔100 μL，每个浓度重复6孔，同时设正常细胞对照，置培养箱中培养，每日观察细胞形态变化，72 h后，采用MTT法检测细胞的吸光值(OD值)，计算PK-15细胞存活率，筛选出CRE对PK-15细胞的最大无毒浓度。细胞存活率(%)=各浓度药物组OD值/空白组OD值×100%。

1.2.3 CRE对TGEV感染PK-15细胞保护作用 将细胞悬液稀释成1×105个/mL接入96孔细胞培养板，细胞丰度达到80%后，分别设置空白组、病毒组、药物对照组和3个试验组，每个组6孔，正常细胞对照组添加维持液200 μL作为对照；病毒组细胞添加100 μL的病毒液感作2 h后，添加维持液培养72 h作为病毒对照；药物对照组添加最大无毒浓度的药物200 μL作为药物对照；试验1组先将病毒和终浓度为最大无毒浓度的药物4 ℃作用2 h，再添加200 μL至细胞上培养72 h；试验2组细胞先感染病毒2 h后，弃病毒液，添加终浓度为最大无毒浓度的维持液200 μL培养72 h；试验3组细胞先添加终浓度为最大无毒浓度的药物200 μL作用48 h，再添加病毒100 μL感染2 h，弃病毒液，添加维持液200 μL培养24 h。试验结束后各组细胞弃培养液，避光添加MTT 20 μL，37 ℃孵育4 h，添加50 μL的二甲基亚砜，充分混匀溶解后，570 nm波长检测OD值，计算PK-15细胞活率。

1.2.4 CRE对TGEV增殖抑制 同“1.2.3”进行分组和试验处理，试验结束后，提取病毒RNA，电泳检测总RNA完整性，紫外分光光度计测定RNA的纯度，反转录为cDNA，参照表1中TGEV引物进行RT-PCR扩增检测TGEV转录水平，反应体系25 μL：cDNA 2.0 μL，PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加RNase free dH2O补至25 μL。反应程序：95 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 45 s，57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环，72 ℃再延伸10 min。

1.2.5 细胞抗病毒相关因子的调节 同“1.2.3”进行分组和试验处理，试验结束后，提取细胞RNA，反转录为cDNA，检测相关因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IRF-3的表达量变化。参照表1中引物进行RT-PCR扩增检测IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IRF-3基因的转录水平。参照表1中各基因引物进性RT-PCR扩增检测转录水平，反应体系 25 μL：cDNA 2.0 μL，PremixTaq12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，加RNase free dH2O补至25 μL。反应程序：95 ℃预变性 5 min； 94 ℃变性 45 s，各基因参照表1退火温度设置，退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，共 35 个循环，72 ℃再延伸10 min。

表1 用于分析猪相关基因的引物序列 Table 1 Primer sequence for analysis of pig-related genes

表2 TGEV感染PK-15细胞结果Table 2 TCID50 results of PK-15 cells infected with TGEV

1.2.6 数据分析及处理 试验数据采用Excel 2003进行收集，SPSS 20.0软件进行方差分析，结果用“平均值±标准差”表示。RT-PCR结果中基因表达强度分别以绝对拷贝数/β-actin绝对拷贝数表示。将病毒组的表达量设置为1×，计算各个基因相对于正常组的表达变化水平。

2 结果与分析

2.1 毒滴度测定

TGEV病毒液经感染细胞试验检测出能使细胞发生病变的数量，按Reed-Muench法计算出TGEV的TCID50为10-3.6/100 μL 稀释的病毒液(表2)。

2.2 CRE对PK-15细胞最大无毒质量浓度测定结果

从表3可知，黄连提取物质量浓度1×10-1g/L时，由于高质量浓度的药物穿透进入细胞后再细胞内进性残留，影响测定的吸光值；质量浓度为1×10-2g/L组的细胞存活率低至25.49%，极显著低于1×10-4g/L以后的剂量组和空白组(P<0.01)；质量浓度为1×10-3g/L组的细胞存活率低至 57.22%，显著低于1×10-4g/L以后的剂量组和空白组(P<0.05)；质量浓度为1×10-4g/L组，细胞存活率达到93.39%以上，之后的质量浓度组间差异不显著(P>0.05)，确定黄连提取物的最大无毒质量浓度为1×10-4g/L。

表3 不同浓度的CRE对PK-15细胞的毒性Table 3 Toxic effects of different concentrations of CRE on PK-15 cells

注：同列数据后不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note:Different uppercase letters in the same column indicate that difference is extremely significant(P<0.01), and the lowercase letters indicate significant difference(P<0.05).The same below.

2.3 CRE对TGEV感染PK-15细胞存活率的 影响

从图1可见，空白组细胞生长良好，呈铺石路样；接种TGEV病毒后病毒组大部分细胞出现拉丝铺网和死亡等现象，细胞存活率极显著低于空白组和其他试验组(P<0.01)；药物对照组保持较高的细胞存活率，与空白组相比较差异不显著(P>0.05)；试验1组的细胞形态未出现典型的拉丝铺网现象，但细胞存活率只达到 54.12%，极显著低于空白组和试验3组(P< 0.01)；试验2组大量的细胞出现病变和死亡，细胞存活率极显著低于空白组和试验2组(P<0.01)；试验3组细胞极少出现病变，细胞存活率达到 87.67%，极显著高于试验1组、试验2组和病毒组(表4，P<0.01)。

A.空白对照组；B.病毒组；C.药物对照组；D.试验1组；E.试验2组；F.试验3组

表4 TGEV感染后PK-15细胞存活率Table 4 PK-15 cells viability after TGEV infection

2.4 CRE对TGEV增殖抑制效果

从图2可知，空白组和药物对照组2个未感染TGEV的细胞病毒检测为阴性，经CRE作用后，3个试验组病毒转录倍数分别降为病毒组的0.438、0.603、0.264倍，并出现极显著差异(P<0.01)，其中试验3组TGEV转录倍数显著低于试验2组(P<0.05)；试验1组低于试验2组，试验3组低于试验1组，但差异不显著(P>0.05)，说明CRE经过3种方式均可以抑制TGEV的 增殖。

2.5 CRE对细胞抗病因子转录的影响

从图3可知，IFN-α基因转录结果：病毒组细胞IFN-α基因的转录量升高，但与空白组相比较差异不显著(P>0.05)；试验1组、试验2组、试验3组细胞IFN-α基因的转录量分别为病毒组的7.13倍、4.35倍、8.51倍，3个试验组均极显著高于空白组、病毒组和药物对照组(P< 0.01)，且试验1组和试验3组极显著高于试验2组(P< 0.01)，试验3组显著高于试验1组(P< 0.05)。

IFN-β基因转录结果：病毒组、药物对照组、空白组间细胞IFN-β基因的转录量间差异不显著(P>0.05)；试验1组、试验2组、试验3组细胞IFN-β基因的转录量分别为病毒组的3.34倍、 3.31倍、5.98倍，3个试验组均极显著高于空白组、病毒组和药物对照组(P<0.01)，且试验3组极显著高于试验1组和试验2组(P<0.01)。

IFN-γ基因转录结果：病毒组与空白组间细胞IFN-γ基因的转录量差异不显著(P>0.05)，试验1组、试验2组、试验3组、药物对照组细胞IFN-γ基因的转录量分别为病毒组的2.28倍、 2.00倍、3.01倍、1.89倍，其中试验3组显著高于试验1组(P<0.05)，极显著高于试验2组、试验3组、药物对照组、病毒组和空白组有(P< 0.01)；试验1组、试验2组和药物对照组显著高于空白组(P<0.05)，极显著高于病毒组(P<0.01)。

IRF-3基因转录结果：病毒组细胞IRF-3基因的转录量低于空白组，但差异不显著(P> 0.05)；试验1组、试验2组、试验3组、药物对照组细胞IRF-3基因的转录量分别为病毒组的 50.63倍、43.49倍、55.74倍、39.94倍，均极显著高于空白组、病毒组(P<0.01)，且试验3组显著高于试验2组和药物对照组(P<0.05)。

“+”表示添加，“1+”和“2+”分别表示添加的顺序，“1+”为先添加，“2+”表示后添加；柱标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下同

“+” indicates addition, “1+” and “2+” indicate order of addition, respectively, “1+” added first, “2+” added；different uppercase letters in the column indicate that difference is extremely significantP<0.01, and the lowercase letters indicate that the difference is significantP<0.05; the same below

图2 CRE对TGEV增殖抑制
Fig.2 CRE inhibition on TGEV proliferation

图3 黄连提取物作用后细胞抗病毒相关因子的转录变化Fig.3 Transcriptional changes of factors related to cellular antiviral after action of Coptidis Rhizoma extract

3 讨 论

TGEV在感染宿主细胞的过程中，病毒与细胞膜上氨肽酶受体(pAPN)的识别位点特异性结合，并吸附在细胞膜表面，在内吞和细胞融合作用下侵入宿主细胞胞浆内，启动繁殖周期，促进病毒在细胞内繁殖[7-8]。试验中，通过3种不同方式感染病毒和添加药物，试验结果也出现明显差异，其中先感染病毒在添加药物作用组的PK-15细胞大量出现死亡，有明显的CPE，细胞存活率达到40.69%，说明细胞受到TGEV入侵后造成了大量的细胞损伤；病毒和药物作用后，同时感染细胞组的细胞得到了一定的缓解，CPE明显减少，细胞存活率达到54.12%，其原因可能是药物直接与病毒接触后，直接起到灭活病毒的作用，降低病毒的感染能力，也有可能是药物同时作用于细胞后，保护细胞免受TGEV入侵，降低其损伤；先添加药物作用后再感染病毒，细胞存活率达到 87.67%，TGEV造成的细胞损伤和病变明显降低，可能是添加药物作用后可以有效刺激细胞产生抗病毒相关物质，有效抵御TGEV入侵来达到保护细胞的效果。同时检测不同方式作用后TGEV N基因的转录变化，3种不同的作用方式TGEV N基因的转录也存在着显著差异，试验3组<试验1组<试验2组，结果显示试验3组的给药方式效果最佳。由此可以表明药物添加的顺序对抵御TGEV感染有明显的作用效果，充分体现出黄连提取物主要是以预防的方式对TGEV进性防治。

在抗病毒过程中，激发细胞分泌抗病毒相关因子是抵御病毒的有效途径。细胞在受到病毒的持续刺激后可促使干扰素通过自分泌和旁分泌作用产生，与同源性细胞表面受体结合形成干扰素-受体复合物而发挥其生物学作用[9]。病毒刺激后，PK-15细胞中只有IFN-α转录量有升高趋势，激发细胞抗病毒的作用，但与空白组相比较差异不显著(P>0.05)，说明细胞自身分泌的IFN-α不足与达到有效抑制TGEV的作用。在药物刺激后，IFN-β、IFN-γ、IRF-3转录量升高，IFN-γ显著高于空白组(P<0.05)，极显著高于病毒组 (P<0.01)；IRF-3极显著高于空白组和病毒组 (P<0.01)，显示黄连提取物可以促使PK-15细胞分泌一些抗病毒相关因子。通过对3中不同方式进行作用后，IFN-α、IFN-β、IRF-3转录量极显著高于空白组、病毒组和药物对照组(P<0.01)，IFN-γ也显著(P<0.05)或者极显著高于空白组和病毒组(P<0.01)。其中IFN-α可以通过增强免疫对病毒感染细胞的免疫杀伤活性，也可以增强巨噬细胞的吞噬功能和细胞毒活性来参与抗病毒作用[10]。IFN-β也主要是参与抗病毒、抗肿瘤作用，其作用方式与IFN-α相似。IFN-γ在参与抗病毒的同时，还参与了部分的免疫调节，促进rRNA合成，促使细胞内的抗原如病毒肽递呈给辅助性T细胞，调节K细胞、NK细胞、巨噬细胞的功能活性[11-12]。激活表达高水平的诱导性一氧化氮合成酶，进而催化精氨酸产生的一氧化氮直接杀伤或产生过氧亚硝酸盐杀伤病毒[12]。IRF-3能结合并活化干扰素α的启动子，启动IFN-α的表达，通过IRF-3的病毒诱导活化而使IFN-β基因表达[13]。同时，IRF-3还参与DNA的损伤修复，抑制病毒诱导的细胞凋亡，进而达到抗病毒效果[14]。因此，可以推测3个试验中，先添加药物刺激后会使细胞产生一定量的细胞因子，在受到病毒入侵后，细胞崩解导致抗病毒相关细胞因子扩散到细胞间隙，增强抗病毒效果。