响应面法优化虎杖大黄素的提取工艺

董加宝 ，彭心洁，贺思

1. 湖南科技学院湘南优势植物资源综合利用重点实验室（永州 425199）；2. 湖南科技学院化学与生物工程学院（永州 425199）

虎杖为蓼科蓼属多年生草本植物的根茎，是我国一种传统中药，大量分布于西北、华东、华中、华南及西南等地，具有悠久的药用历史。虎杖中除白藜芦醇外最重要的活性成分是虎杖大黄素，大黄素可通过抑制血小板衍生生长因子、转化生长因子来阻断肝星状细胞的活化，从而发挥抗纤维化作用[1-2]。大黄素还对肝纤维化肺损伤具有一定的保护作用[3]，增加巨噬细胞识别和吞噬能力，减轻炎症反应[4]、保护心肌细胞、减轻心肌炎症[5-6]。研究表明，大黄素对非酒精性脂肪肝有治疗作用[7-9]，可预防胆固醇结石的形成[10]、抑制金黄色葡萄球菌[11-12]、抗肿瘤[13]，在食品工业上可以起到抗氧化、抑制食品糖基化产物形成的作用[14]。

目前，从虎杖花及果实中提取大黄素主要方法有双水相萃取[15]、正交试验提取[16]、超声辅助提取[17-18]。试验以虎杖根为原料，采用响应面法优化虎杖中大黄素的提取工艺条件，以期为优化虎杖大黄素的提取提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大黄素标准品（成都克洛玛生物科技有限公司）；虎杖根（采自永州市零陵区西山，放置于80 ℃烘箱中烘干，经粉碎后过100 目筛得虎杖粗粉，避光保存备用）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；三氯甲烷、乙酸乙酯、无水乙醇、乙醚（均为分析纯，天津市大茂化学试剂厂）。

1.2 仪器与设备

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津有限公司）；JA1003N电子天平（上海菁海仪器有限公司）；FW177粉碎机（湖南东晟电子有限公司）；DZF-6050真空干燥箱、SHB数显三用恒温水箱（巩义市英谷高科仪器厂）。

1.3 虎杖根大黄素提取单因素试验

不同溶剂对大黄素的提取效果：称取5份0.5 g的虎杖粗粉，倒入试管中，在30 ℃下分别取用10 mL的95%乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、水、乙醚振荡浸提30 min，取浸提液过滤，测定提取率。

不同溶剂浓度对大黄素的提取效果：配置体积分数为65%，70%，75%，80%和85%的乙醇溶剂，分别振荡浸提30 min后，取浸提液过滤，测定提取率。

不同温度对大黄素的提取效果：分别在20，30，40，50和60 ℃的温度下，加入75%乙醇，振荡浸提30 min后，取浸提液过滤，测定提取率。

不同时间对大黄素的提取效果：振荡提取时间分别为10，20，30，40和50 min，取浸提液过滤后测定提取率。

不同料液比对大黄素的提取效果：取相同量虎杖粉在40 ℃下，按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20和1∶25（g/mL）加入75%乙醇溶剂，浸提30 min，取浸提液过滤，测定提取率。

1.4 响应面试验设计优化提取条件

以乙醇体积分数（A）、提取时间（B）和提取温度（C）为自变量，以虎杖大黄素提取率为响应值，用Design-Expert 8.0.6软件进行三因素三水平Box-Behnken试验设计，因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.5 大黄素的测定方法

取1 mL提取液，转移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤膜滤过、脱气后按寿林均等[19]的方法测定。

2 结果与分析

2.1 不同溶剂种类对虎杖大黄素提取率影响

由图1可知，在其他条件相同的情况下，用95%乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、水以及乙醚对虎杖大黄素进行提取，其中以95%乙醇的提取率最高，且乙醇无毒、安全性高。因此，选用乙醇作为虎杖根大黄素的最佳溶剂。

2.2 不同溶剂体积分数对虎杖大黄素提取率的影响

从图2可知，乙醇体积分数为75%时提取率最高，当体积分数继续升高时，提取率有下降的趋势。相关研究也表明乙醇体积分数过高会增加其他杂质的溶出量，从而导致大黄素提取率的下降[17]。故选用75%的乙醇进行进一步研究。

2.3 不同提取温度对虎杖大黄素提取率的影响

从图3可以得出，随着提取温度的升高，虎杖大黄素的提取率先上升后下降，当提取温度达到40 ℃时，提取率达到最高，随后开始下降。相关研究也表明温度升高能加快大黄素溶解到乙醇中，但是当温度达到一定值时，提取率下降是因为偏高的温度造成溶剂的挥发和大黄素分子的部分氧化分解[17]。

图1 不同溶剂种类对虎杖大黄素提取率的影响

图2 不同溶剂体积分数对大黄素提取率的影响

图3 不同提取温度对大黄素提取率的影响

2.4 不同提取时间对虎杖大黄素提取率的影响

从图4可知，随着提取时间的延长，虎杖大黄素的提取率先上升后下降，当提取时间为30 min时提取率达到最大值，之后随着时间的延长，提取率开始有下降的趋势。刘树兴等[18]采用80%乙醇+丙酮超声提取大黄素也发现提取时间到达巅峰后会轻微缓慢下降，其原因可能是发生部分氧化。因此，提取时间选取30 min为宜。

2.5 不同料液比对虎杖大黄素提取率的影响

从图5可以得出，随溶剂体积增加，大黄素的提取率先上升后趋于稳定，1∶15（g/mL）后上升缓慢，为确保充分提取，实际操作选择料液比1∶20（g/mL）进行提取。

图4 不同提取时间对大黄素提取率的影响

图5 不同料液比对大黄素提取率的影响

2.6 响应面法优化虎杖根大黄素提取工艺

2.6.1 响应面试验设计与结果

由于料液比在1∶20（g/mL）时提取率基本达到稳定状态，兼顾提取效率与节省溶剂，选取乙醇体积分数（A）、提取时间（B）和提取温度（C）按表1对虎杖中大黄素的提取工艺进行优化，结果见表2。

表2 响应面试验设计与结果

2.6.2 数据模型建立与回归分析

采用Design-Expert 8.0.6软件三因素三水平Box-Behnken试验设计对表2数据进行二次多项式逐步回归拟合，回归方程为：

Y=0.58+0.002 25A+0.001 125B+0.004 125C+0.002 25AB-0.000 75AC-0.011A2-0.019B2-0.031C2

一次项系数值的大小可以反映因素对响应值的影响程度，由回归方程可得出提取虎杖根大黄素的主次影响因素顺序为：浸提温度＞乙醇体积分数＞浸提时间。

2.6.3 回归模型的方差分析

为进一步确定模型可靠性，通过软件得到的模型方差分析结果和各项系数显著性检验结果见表3。

从表3中可知，模型中p＜0.000 1，说明此次试验采用的二次模型是十分显著的。p、p、p2、p2、p2ACABC的值均小于0.05，说明乙醇体积分数、提取温度与三个因素的二次项均具有显著影响；而提取时间、交互项及失拟项项显著性较差。失拟项p=0.066 7＞0.05，表明无失拟因素存在，各因素的效应关系为提取温度＞乙醇体积分数＞提取时间。

表3 回归模型各项方差分析

2.6.4 响应面分析

响应曲面的坡度陡峭程度说明影响因素对响应值的影响大小[20]。从3D响应面图（图6～图8）可以看出，各个因素对大黄素提取得率的影响程度。图8的响应面较为陡峭，说明超声时间和浸提时间的交互作用较大，但是由表3可知，三个交互作用均未达到显著性水平。

2.6.5 提取条件的优化及验证试验

通过软件回归方程对虎杖大黄素进一步优化，由以上结果分析得到最佳提取工艺：乙醇体积分数75.51%、提取时间30.34 min、提取温度40.65 ℃、料液比1∶20（g/mL）。结合实际条件，最佳工艺选取75.5%乙醇、提取温度40.6 ℃、提取时间30 min，经3次平行试验测得平均提取率为0.577%，与预测值0.579%相近，相对误差为0.35%。采用响应面法优化虎杖中大黄素提取工艺条件是合理可行的。

图6 乙醇体积分数和提取时间对虎杖大黄素提取交互作用

图7 乙醇体积分数和提取温度对虎杖大黄素提取交互作用

3 结论

在单因素试验的基础上，采用响应面法优化虎杖根大黄素的提取工艺条件，得出虎杖根大黄素的最佳提取工艺条件：乙醇体积分数75.5%、提取时间30 min、提取温度40.6 ℃、料液比1∶20（g/mL）。在此条件下大黄素得率可达0.577%。