新型冠状病毒核酸提取与扩增试剂匹配的检测结果分析

刘应芬，余昌秀，曹 玲，李青峰

(成都市公共卫生临床医疗中心检验科，四川 成都 610016)

2019年12月以来，湖北省武汉市陆续发现了多例新型冠状病毒(2019-nCoV)的肺炎患者，随着疫情的发展，新型冠状病毒引起了全中国乃至全世界的高度关注[1]。目前对2019-nCoV诊断起决定作用的任然是病毒核酸检测分析[2]。然而，目前核酸检测假阴性率仍然较高。假阴性的原因从检测方面分析可能在于以下几个方面，首先与试剂盒的特异性、灵敏度和稳定性相关，其次，试剂盒的质量有待进一步提高[3，4]。核酸检测主要分为两个步骤进行即核酸提取和核酸扩增。本研究拟通过对核酸提取试剂与扩增试剂是否匹配的检测结果进行比较分析，评价试剂匹配与否的优劣，供实验室参考，尽可能降低核酸检测的假阴性率。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集本院2020年2月19日当天23例疑似和确诊新冠患者的的咽拭子标本。

1.2 方法RNA的提取：分别采用达安全自动提取仪(提取试剂批号2019003，磁珠法)和圣湘手工RNA提取试剂(批号2020002，磁珠法)严格按照说明书进行提取。核酸扩增：按仪器使用说明或标准操作程序操作。达安：通道设置为通道1：FAM； 通道2：HEX； 通道3：TREA-RE；通道4：CY5，循环程序50 ℃15分钟；95 ℃15分钟，94 ℃15秒—55 ℃45秒45个循环；荧光收集在55 ℃。圣湘：通道设置为通道1：FAM； 通道2：HEX； 3：ROX，循环程序如下：50 ℃30分钟；95 ℃1分钟，95 ℃15秒—60 ℃30秒45个循环，25 ℃10秒冷却；荧光收集在60 ℃。

1.3 结果判读达安扩增试剂：如果检测样品在FAM通道和HEX通道无明显扩增曲线或CT值>38，可判读为2019-nCoV阴性；如果检测样品在FAM通道和HEX通道CT值≤38，且曲线有明显的扩增曲线，可判读为2019-nCoV阳性。圣湘扩增试剂：如果检测样品在FAM通道且ROX通道无明显扩增曲线或CT值》40，HEX通道有扩增曲线，检测CT值≤40，可判读为2019-nCoV阴性；如果检测样品在FAM通道或ROX通道CT值≤40，且曲线有明显的扩增曲线，可判读为2019-nCoV阳性。

1.4 统计学方法本研究数据采用Excel 2007进行分析，通过计算各组合核酸检出率来分析不同试剂组合的差异。率的比较采用卡方检验，P小于0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两种试剂的基本资料达安试剂(A)和圣湘试剂(B)两种试剂的基本情况见表1。两种试剂中的RNA提取均采用磁珠提取法，检测基因均为ORF1ab和N基因。

表1 两种试剂的基本情况

2.2 检测结果分析不同试剂匹配的检测结果见表2和表3。用A提取的23份RNA加入A扩增试剂进行检测，得到7例新冠核酸阳性，检出率为30.43%；用B提取的RNA加入A扩增试剂进行检测，得到4例新冠核酸阳性，检出率为17.39%。用A提取的23份RNA加入B扩增试剂进行检测，得到4例新冠核酸阳性，检出率为17.39%；用B提取的RNA加入B扩增试剂进行检测，得到8例新冠核酸阳性，检出率为34.78%。匹配的试剂组检出率高于交叉组。

表2 A扩增试剂的检测结果

表3 B扩增试剂的检测结果

3 讨论

本研究比较了两个公司的核酸提取试剂与核酸扩增试剂的匹配与否的检测结果，结果显示两个公司自己的提取试剂匹配自己的扩增试剂检测ORF1ab、N基因的检出率高于核酸提取试剂与扩增试剂交叉检测率。

对于新型冠状病毒的检测，我们严格按照中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南(第三版)》对23例可疑和确诊患者的咽拭子样本进行检测，结果表明两家公司的试剂均可以检测出ORF1ab基因和N基因，但是核酸提取试剂与核酸扩增试剂匹配不同，检出率是有差异的。这种差异的原因之一可能与试剂引物设计有关，又一原因可能是各试剂盒受样本本身的来源及其质量、样本转运条件、样本预处理的影响不同而引起差异[5～7]。

新冠肺炎疫情是突发的公共卫生事件，各试剂厂商都是在极短的时间内完成试剂盒的研发和审批，试剂盒的质量和一些性能参数设置难免有不足之处，这对我们实验室就要求更加严格的质量控制。各实验室可根据自身情况，尽可能选择能提高核酸检出率的试剂盒，为临床诊断治疗提供更加可靠的依据。