仙茅化学成分的研究

陈 丽， 康 敏， 邓小宽， 吴 众， 曾邦国， 高 平

(1. 四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室， 成都 610065;2. 成都地奥制药集团有限公司，成都 610041； 3. 四川国强中药饮片有限公司，成都 610200)

1 引 言

仙茅(Curculigo orchioides Gaertn)是一种具有长圆柱形根状茎的小型草本植物[1]，又名地棕、独茅、山党参、海南参、婆罗门参，主产于四川、贵州、云南、广西等地[2]，以其“壮阳活性”而闻名[3]. 有研究表明仙茅提取物还具有诱导巨噬细胞活化[4]、免疫调节[5]、抗骨质疏松[6]、抗氧化作用[7]、抑菌[8]、神经保护[3]、防止顺铂诱导的细胞损伤[9]等作用. 因此，该植物具有极大的药用价值，但目前多数药理活性研究还基本处于仙茅的粗提物层面，其作用机制及其具体作用成分还有待于进一步深入研究.

目前就仙茅化学成分的研究可知，仙茅富含多糖、皂苷、酚类、酚苷、萜类等化合物[6]，其中仅酚苷类物质“仙茅苷”被纳入《中国药典》作为药材的质量控制指标. 然而，汪滢等[10]在测定仙茅中多种酚苷类成分时，结果发现不同产地仙茅药材中酚苷类成分的含量差异较大，以苔黑酚类化合物的含量最高，其次为仙茅苷. 相关研究说明用单一指标来评价药材的质量存在明显缺陷，研究寻找仙茅中更多的其它相关成分，进一步为仙茅建立多成分质量控制方法是必须的，也是极为重要的.

为了进一步明确仙茅中的化学成分，以期为今后仙茅的活性筛选、指纹图谱以及质量控制研究奠定基础. 本实验对仙茅甲醇提取物的正丁醇萃取部位进行了系统的化学成分研究，共分离鉴定了 10个化合物，分别为2, 6-二甲氧基苯甲酸(1)、咖啡酸(2)、原儿茶酸(3)、orchioside B (4)、curculigoside C(5)、orchioside E(6)、丁香酸(7)、hemsleyanumoide(8)、丁香酸葡萄糖苷(9)、绿原酸(10).

2 材料与方法

2.1 材 料

干燥仙茅根茎由四川国强中药饮片有限公司鉴定并提供. 所用试剂均为分析纯或色谱纯(成都科龙化工试剂厂). 高速中药粉碎机(浙江瑞安市永历制药机械有限公司，150摇摆式)；LC3000高效液相色谱仪(UV3000紫外检测器，P3000高压输液泵，北京创新通恒科技有限公司)，色谱柱InertSustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm，Sepax Sapphire)；C18柱(YMC-C18-10 μm)；制备仪(北京创新通恒科技有限公司)；柱色谱用硅胶 200-300目(成都科龙化工试剂厂)；玻璃层析柱(直径10 cm，北京创新通恒科技有限公司)；MicrOTOF QⅡ(德国Bruker公司)；Bruker Avance Ⅱ-400 MHz 和 Bruker Avance Ⅱ-600 MHz spectrometer(德国Bruker公司).

图1 仙茅甲醇提取物正丁醇部位的分离流程图

2.2 方 法

2.2.1 提 取 取干燥的仙茅根茎6 kg粉碎，用40 L甲醇进行渗漉提取，提取液经55 ℃旋蒸浓缩至无醇味，加少量水混悬后，用正丁醇连续萃取3次，合并萃取液并减压干燥，得到仙茅正丁醇萃取物.

2.2.2 分离纯化 采用1 kg硅胶进行湿法装柱(石油醚)，正丁醇萃取物经甲醇溶解，加入0.5 kg硅胶混匀拌干后进行干法上样. 分别用乙酸乙酯/石油醚(1/1)、乙酸乙酯以及乙酸乙酯/甲醇(100/1、50/1、20/1、10/1、5/1)梯度洗脱. 经HPLC检测合并相似流份，得到4个组分(Fr. A-D). Fr. A进一步经C18中压色谱柱，20%-40%甲醇梯度洗脱，得到含有化合物1、2、3、7四个成分含量较多的两个粗分段Fr. A-1和Fr. A-2；每个分段经过高压制备色谱，均以10%～20%乙腈水的梯度进行细分离，经过几次重复柱层析，得到上述4个单体. Fr. B经各种柱层析未能得到高纯度化合物. Fr. C经C18中压色谱柱，20%～40%甲醇梯度洗脱，得到Fr. C-1～3，其中Fr. C-3经高压色谱系统，15%～20%乙腈水洗脱，重复高压制备层析两次，得到纯度高的化合物4. Fr. C-2段经10%～15%乙腈水多次高压制备色谱系统层析，得到纯的化合物5、6. Fr. D经C18中压色谱柱，20%～40%甲醇梯度洗脱，得到组分Fr. D-1、Fr. D-2. 其中Fr. D-1与Fr. C-1经5%乙腈水洗脱过后的残余浸膏合并，再经10%乙腈水多次高压制备色谱系统层析，得到化合物8、9、10.

3 化合物结构鉴定

化合物1：无色针晶.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.73 (s, 1H, COOH), 7.31 (t, J = 8.4 Hz, 1H, H-4), 6.68 (d, J = 8.4 Hz, 2H, H-3, H-5), 3.75 (s, 6H, OMe-2, OMe-6);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 167.19 (s, COOH), 156.57 (s, C-2, C-6), 130.90 (s, C-4), 114.78 (s, C-1), 104.58 (s, C-3,C-5), 56.21 (s, OMe-2, OMe-6). 以上数据与文献报道基本一致[11]，故化合物1鉴定为2,6-二甲氧基苯甲酸，其分子式为C9H10O4.

化合物2：白色片状结晶.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.13 (s, 1H，COOH), 9.54 (s, 1H, OH), 9.15 (s, 1H，OH), 7.42 (m, 1H, H-7), 6.97 (m, 2H，H-2, H-6), 6.77 (t, J = 16.9 Hz, 1H, H-5), 6.18 (d, J = 15.9 Hz, 1H, H-8);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 168.38 (s, COOH), 148.59 (s, C-7), 146.01 (s, C-4), 145.06 (s, C-3), 126.15 (s, C-1), 121.62 (s, C-8), 116.20 (s, C-2), 115.56 (s, C-5), 115.08 (s, C-6). 以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物2为咖啡酸，分子式为C9H8O4，并且首次在仙茅植物中得到.

化合物3：无色针晶.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.33 (s, 1H, COOH), 9.68 (s, 1H, OH), 9.31 (s, 1H, OH), 7.46 - 7.21 (m, 2H, H-2, H-6), 6.80 (d, J = 8.2 Hz, 1H, H-5);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 167.77 (s, C-7), 150.46 (s, C-4), 145.33 (s, C-3), 122.36 (s, C-6), 122.09 (s, C-1), 116.99 (s, C-2), 115.61 (s, C-5). 以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物3物质为原儿茶酸，分子式为C7H6O4.

化合物4：白色固体. ESI-MS at m/z 460.87 [M - H]-.1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.85 (m, 2H, H-2'', H-6''), 6.93 (d, J = 2.0 Hz, 1H, H-2'), 6.82 (m, 3H, H-3'', H-5'', H-5'), 6.75 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-6'), 4.80 (d, J = 8.5 Hz, 1H, H-1'''), 4.57 (d, J = 6.0 Hz, 1H, H-1), 4.50 (s, 1H, H-2), 3.86 (dd, J = 12.0, 2.2 Hz, 1H, H-6'''), 3.69 (dd, J = 12.0, 5.6 Hz, 1H, H-6'''), 3.62 (dd, J = 9.3, 8.7 Hz, 1H, H-2'''), 3.50 (t, J = 9.0 Hz, 1H, H-3'''), 3.39 (m, 1H, H-5'''), 3.31 (m, 1H, H-4'''), 3.11 (ddd, J = 17.3, 8.8, 5.3 Hz, 1H, H-4), 3.02 (ddd, J = 17.3, 8.5, 6.8 Hz, 1H, H-4), 2.05 (m, 1H, H-3), 1.81 (m, 1H, H-3);13C NMR (151 MHz, MeOD) δ 199.30 (s, C-5), 162.34 (s, C-4''), 145.13 (d, C-3'), 144.96 (d, C-4'), 130.48 (s, C-1'), 130.36 (s, C-2'', C-6''), 128.60 (s, C-1''), 119.34 (s, C-6'), 114.81 (d, C-2', C-5'),114.76 (d, C-3'', C-5''), 96.03 (s, C-1'''), 78.54 (s, C-5'''), 78.10 (s, C-1), 74.60 (s, C-3'''), 74.21 (s, C-2), 72.43 (s, C-2'''), 70.51 (s, C-4'''), 61.15 (s, C-6'''), 33.24 (s, C-4), 26.07 (s, C-3). 以上数据与文献报道基本一致[14]，故化合物4物质为orchioside B，分子式为C23H26O10.

化合物5：白色固体. ESI-MS at m/z: 504.78 [M+Na]+.1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.09 (d, J = 8.8 Hz, 1H, H-3), 6.92 (d, J = 3.0 Hz, 1H, H-6), 6.87 (d, J = 8.9 Hz, 1H, H-4'), 6.71 (dd, J = 8.8, 3.0 Hz, 1H, H-5'), 6.65 (d, J = 8.9 Hz, 1H, H-4), 5.44 (dd, J = 30.2, 13.0 Hz, 2H, H-7), 4.77 (d, J = 7.5 Hz, 1H, H-1''), 3.75 (d, J = 10.8 Hz, 6H, H-2', H-6', OCH3), 3.70 (dd, J = 12.0, 5.3 Hz, 1H, H-6''a), 3.42 (ddd, J = 36.8, 15.6, 8.0 Hz, 4H, H-2'', H-3'', H-5'', H-6''b) , 3.31 (dt, J = 3.2, 1.6 Hz, 1H, H-4'');13C NMR (151 MHz, MeOD) δ 166.69(s, C-7'), 152.54(s, C-5), 149.71 (s, C-2), 148.45(s, C-6'), 145.15 (s, C-2'), 143.84 (s, C-3')，127.15(s, C-1), 118.77(s, C-1'), 117.56 (s, C-3, C-4'), 115.29 (s, C-4), 115.09 (s, C-6), 107.26 (s, C-5'), 102.87 (s, C-1''), 76.72 (d, C-3''), 76.65 (d, C-5''),73.62 (s, C-2''), 70.01 (s, C-4''), 61.99 (s, C-7), 61.21 (s, C-6''), 60.42 (s, C-2'-OMe), 55.63 (s, C-6'-OMe). 以上数据与文献基本一致[11]，故鉴定化合物5物质为curculigoside C，分子式为C22H26O12.

化合物6：白色固体. HR-ESI-MS at m/z 461.08 [M - H]-.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.75 (d, J = 8.7 Hz, 2H, H-2'', H-6''), 6.81 (m, 3H, H-2', H-3'', H-5''), 6.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H, H-5'), 6.60 (dd, J = 8.1, 1.3 Hz, 1H, H-6'), 4.67 (s, 1H, H-1'''), 4.49 (d, J = 7.9 Hz, 1H, H-1), 4.08 (dt, J = 11.3, 3.4 Hz, 1H, H-2), 3.70 (d, J = 11.2 Hz, 2H, H-6'''), 3.30 (m, 2H, H-2''', H-3'''), 3.16 (m, 1H, H-5'''), 3.03 (m, 1H, H-4'''), 2.83 (dd, J = 16.7, 8.3 Hz, 2H, H-4), 2.02 (dd, J = 7.1, 4.0 Hz, 1H, H-3), 1.31 (m, 1H, H-3).13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 198.14 (s, C-5), 162.35(s, C-4''), 145.41(s, C-3'), 144.80(s, C-4'), 130.71 (s, C-2'', C-6''), 129.30 (s, C-1'), 128.76 (s, C-1''), 117.12 (s, C-6'), 115.72 (s, C-2'), 115.65 (s, C-3'', C-5''), 113.72 (s, C-5'), 92.71 (s, C-1'''), 80.95 (s, C-5'''), 79.19(s,C-1),78.75 (s, C-3'''), 77.00 (s, C-2), 73.66(s, C-2'''), 71. 19 (s, C-4'''), 61.35(s, C-6'''), 33.68 (s, C-4), 19.91 (s, C-3). 以上所得数据和文献对类似化合物进行了分析, 以上的光谱数据与之前Gupta等[14]发表的关于orchioside B(化合物4)的数据非常相似. 化合物6的H-2(δ 4.08)、H-3(δ 1.31)与orchioside B的H-2(δ 4.36)、H-3(δ 1.86)的化学位移存在明显差异. 同时，化合物6的C- 2(δ 77)、C-3(δ 19.91)与orchioside B的C- 2(δ 74.4)、C-3(δ 26.8)的化学位移也呈现出明显差异. 经检索，这是第一个关于化合物6的报道，是化合物4的同分异构体，将其命名为orchioside E，分子式为C23H26O10.化合物6的结构及HMBC相关信号见图2.

图2 化合物6的结构及HMBC相关信号Fig.2 Structure and selected HMBC correlations of compound 6

化合物7：白色固体.1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 12.61 (s,1H，COOH), 9.21 (s,1H，OH), 7.22 (s, 2H, H-2, H-6), 3.82 (s, 6H，OMe-2, OMe-6);13C NMR (101 MHz, DMSO) δ 167.71 (s, COOH), 147.89 (s, C-4), 140.64 (s, C-3, C-5), 120.81 (s, C-1), 107.29 (s, C-2, C-6), 56.41 (s, OMe-2, OMe-6). 以上数据与文献基本一致[12]，鉴定化合物7为丁香酸，分子式为C9H10O5.

化合物8：白色固体. ESI-MS at m/z 460.80 [M - H]-.1H NMR (600 MHz, MeOD) δ 7.63 (m, 2H, H-2, H-6), 7.16 (d, J = 8.5 Hz, 1H，H-5), 5.55 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-1''), 5.10 (d, J = 7.7 Hz, 1H, H-1'), 4.17 (d, J = 9.8 Hz, 1H, H -4''), 3.96 (d, J = 1.3 Hz, 1H, H-2''), 3.88 (m, 4H, OMe, H-6'), 3.76 (m, 2H, H-2', H-4''), 3.68 (dd, J = 12.2, 5.6 Hz, 1H, H-6'), 3.62 (t, J = 9.0 Hz, 1H, H-3'), 3.52 (m, 2H, H-5''), 3.46 (ddd, J = 9.7, 5.6, 2.3 Hz, 1H, H-5'), 3.43 (m, 1H, H-4');13C NMR (151 MHz, MeOD) δ 168.21(s, C-7)，150.61 (s, C-4), 148.94(s, C-3), 124.37(s, C-6)，123.19 (s, C-1), 114.43 (s, C-5), 112.79 (s, C-2), 108.87 (s, C-1''), 98.96 (s, C-1'), 79.42 (s, C-3''), 77.36(s, C-3'), 76.77 (s, C-5'), 76.52 (s, C-2''), 75.98 (s, C-2'), 74.11 (s, C-4''), 69.97 (s, C-4'), 64.78 (s, C-5''), 61.05 (s, C-6'), 55.02 (s, OMe). 以上数据与文献基本一致[15]，故化合物8物质鉴定为hemsleyanumoide，分子式为C19H26O13，首次在该种植物中发现，也是首次在仙茅属中发现.

化合物9：白色粉末. ESI-MS at m/z 358.85 [M - H]-.1H NMR (600 MHz, DMSO) δ 12.89 (s, 1H, COOH), 7.23 (s, 2H, H-2, H-6), 5.12 (d, J = 7.4 Hz, 1H, H-1'), 3.81 (s, 6H, OMe-2, OMe-6);13C NMR (151 MHz, DMSO) δ 167.36 (s, COOH), 152.72 (s, C-3, C-5), 138.69 (s, C-4), 126.09 (s, C-1), 107.81 (s, C-2, C-6), 102.41 (s, C-1'), 77.84 (s, C-3'), 77.10 (s, C-5'), 74.65 (s, C-2'), 70.36 (s, C-4'), 61.28 (s, C-6'), 56.84 (s, OMe-2, OMe-6). 以上数据与文献报道基本一致[2]，化合物9鉴定为丁香酸葡萄糖苷，分子式为C15H20O10.

化合物10：白色固体. ESI-MS at m/z 352.69 [M - H]-.13C NMR (151 MHz, MeOD) δ174.13(m, C-7'), 167.64 (m, C-9), 148.13 (s, C-3), 145.64 (s, C-7), 145.37 (s, C-4), 126.43 (s, C-1), 121.56 (s, C-6), 115.12 (s, C-2), 114.03 (s, C-5), 113.83 (s, C-8), 75.17(m, C-1'), 72.93 (s, C-4'), 71.25(m, C-5'), 70.56(m, C-3'), 38.55 (m, C-2'), 36.95 (m, C-6'). 上述数据与文献报道基本一致[16]，故化合物10鉴定为绿原酸，分子式为C16H18O9.

4 讨 论

此次分得的化合物主要分为两大类，即酚酸类物质和酚苷物质. 其中，化合物6为1个新的酚苷类物质，命名为orchioside E；化合物2和8则首次在仙茅科仙茅属植物中分离得到. 该结果拓宽了对仙茅物质基础的认识，也为合理有效开发利用该资源提供了科学依据. 其中属于酚酸类物质的咖啡酸[17]、原儿茶酸[18]、丁香酸[19]、绿原酸[20]在已有报道中表明具有较好的生物活性. 因此，除酚苷类物质代表“仙茅苷”外，具有较好生物活性的酚酸类成分可考虑作为仙茅药材质量控制指标的选择之一，而对于得到的新物质后续可进一步研究其生物活性.