山楂叶标准汤剂指纹图谱及抗氧化活性谱效关系研究

王子怡，穆文成，李艳荣，洪 霞，潘海峰

承德医学院河北省中药研究与开发重点实验室，承德 067000

山楂叶是蔷薇科植物山里红CrataeguspinnatifidaBge.var.majorN.E.Br或山楂CrataeguspinnatifidaBge.的干燥叶，具有活血化瘀，化浊降脂的功效[1]。山楂叶标准汤剂是参考现代提取方法，经标准化工艺制备成的单味山楂叶饮片水煎剂[2]。研究表明，山楂叶的主要生理活性成分为黄酮类[3-7]，黄酮类化合物可能是除维生素C之外的另一类天然抗氧化剂[8,9]。由于山楂叶标准汤剂主要为极性成分，其抗氧化活性较强，清除自由基的能力是评价其抗氧化能力的一个重要指标[10]。关于抗氧化的化学分析方法主要包括ABTS自由基清除法和DPPH自由基清除法，通过化学法能够确定天然产物清除自由基或对抑制脂类物质氧化的能力，从而评价天然产物的抗氧化活性。运用ABTS自由基清除法是因为该方法操作简单，不需要复杂的反应步骤及难以实现的反应条件，并且去除了测试物质中含有的过氧化物对ABTS自由基清除自由基的影响，能够准确确定多组分混合物的抗氧化能力，因此它更多地用于评价天然产物的抗氧化活性[11,12]。DPPH自由基清除实验是一种简单、有效且经济的方法，测出的结果重复性较好，受环境因素的影响较小[13]，同其它抗氧化活性的测定方法相比，该方法具有较高的灵敏度，没有伴随复杂反应，并能够与色谱分离法相结合，常用于在线检测天然产物的抗氧化活性[14]。

由于中药标准汤剂大多具有作用机制复杂，作用靶点多样等特点，需要对其进行整体质量控制，通过共有峰标定和相似度评价等手段能够较全面体现中药整体性的指纹图谱是符合标准汤剂特点的方法之一[15]。另一方面，中药药效的发挥有赖于多个成分的协同作用，指纹图谱虽能标示中药中的多种成分，但这些化学成分的标示与中药药效的发挥可能不完全一致，因此仅仅研究中药的化学指纹图谱还远远不够，只有将中药的化学指纹图谱与中药的药效紧密结合起来，建立具有实际意义的谱-效关系，才能为中药质量控制提供更科学的依据[16]。

目前关于山楂叶标准汤剂及其抗氧化活性谱效关系的研究未见报道，本文通过DPPH自由基和ABTS自由基清除法评估山楂叶标准汤剂黄酮类成分抗氧化活性，分析标准汤剂抗氧化作用，并采用灰关联度法研究其HPLC指纹图谱与抗氧化活性的谱效关系，为山楂叶标准汤剂的质量标准制定提供有效依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，JA2003上皿天平(上海精科天平)，电热套(通州市申通电热器厂)，AG-245型电子分析天平(瑞士梅特勒-托利公司)，HC-2062高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)，酶标仪(Thermo Fisher Scientific)，KQ-2200DE超声波清洗器(哈尔滨东明医疗仪器厂)。

1.2 试剂

甲醇、乙腈(色谱纯，Fisher科技有限公司)，其他试剂均为分析纯，水(杭州娃哈哈有限公司)，DPPH自由基(464RB-GE，上海化成工业发展有限公司)，ABTS自由基(M0403A，泽浩公司)，维生素C(J1024A，泽浩公司)。

1.3 对照品

绿原酸(161217，成都普菲得生物技术有限公司)，牡荆素葡萄糖苷(171403，成都普菲得生物技术有限公司)，芦丁(120226，上海融禾医药科技有限公司)，金丝桃苷(161231，上海融禾医药科技有限公司)，牡荆素鼠李糖苷(111668-2000602，中国药品生物制品检定所)。

1.4 材料

16批山楂叶药材由承德民族师范学院董建新教授鉴定为蔷薇科植物山楂叶。样品标本存放在承德医学院中药研究所。样品信息见表1。

表1 样品信息

2 方法

2.1 色谱条件

采用Agilent Extend-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，0.2%甲酸水-乙腈(A-B)梯度洗脱；流速设定为0.8 mL/min；进样量10 μL；检测波长为320 nm；柱温为30 ℃，洗脱梯度见表2。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准汤剂的制备[2]

精密称定山楂叶粗粉100 g，置于圆底烧瓶中，加入蒸馏水1 200 mL浸泡30 min，用电热套以1 d/s的滴速加热回流，第1次30 min，回流完毕趁热用3层纱布过滤，残渣加1 000 mL蒸馏水第2次回流20 min，回流完毕趁热用3层纱布过滤，合并2次滤液，采用冷凝水循环装置水浴蒸发45 ℃减压浓缩至500 mL，即得棕色或绿色浓度为0.2 g/mL的山楂叶标准汤剂。

表2 洗脱梯度

2.2.2 供试品溶液的制备

取山楂叶标准汤剂1 mL与16%乙腈1 mL混匀，以12 000 rpm超速离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作供试品溶液。

2.2.3 阳性对照维生素C溶液的制备

精密称取维生素C，以蒸馏水溶解，配制成1.928 mg/mL的Vc溶液。

2.2.4 DPPH自由基溶液的制备

精密称取DPPH自由基12.00 mg，放置于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度线，即得0.12 mg/mL的DPPH自由基溶液，避光备用。

2.2.5 ABTS自由基溶液的制备

精密称取ABTS自由基38.40 mg，用蒸馏水定容至10 mL容量瓶，即得3.84 mg/mL的ABTS自由基初始溶液。精密称取过硫酸钾13.40 mg，放置于10 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线即得过硫酸钾溶液。ABTS自由基初始溶液和过硫酸钾溶液各取2.5 mL，放置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线即得ABTS自由基溶液，避光放置12～16 h备用。

2.2.6 数据处理

IC50值计算时，由于各提取液对自由基的清除率与浓度不呈线性关系，因此使用SPSS19.0中Probit方法进行回归分析，拟合得相应的方程Probit(p)=Intercept+Bx，再通过卡方检验后得到IC50值(Probit=0.50时提取液的生药浓度)，IC50值越小表示提取液的抗氧化能力越强。

2.3 指纹图谱的建立

2.3.1 方法学考察

2.3.1.1 稳定性试验

取山楂叶标准汤剂的供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，在不同的时间点(0、4、6、8、10、24 h)分别进样，计算18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，得出RSD分别为小于1.5%和小于2.0%。表明山楂叶标准汤剂在24 h内稳定。

2.3.1.2 精密度试验

取“2.2.1”项制得的标准汤剂，按上述方法连续进样6次样品，以牡荆素葡萄糖苷的峰面积和保留时间为参照计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间的RSD分别小于0.8%和小于1.0%。表明仪器精密度良好。

2.3.1.3 重复性试验

取同一标准汤剂6份，按“2.2.2”项下方法分别制备供试品溶液进行测定，计算18个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别低于0.8%和低于1.0%。表明该方法重复性良好。

2.3.2 样品指纹图谱的确定

将16批山楂叶标准汤剂HPLC色谱图输入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统 2004A版》进行数据处理，设S1为参照图谱，时间窗宽度0.40。以中位数法生成对照图谱，可得山楂叶标准汤剂HPLC指纹图谱色谱叠加图。

2.4 不同产地山楂叶标准汤剂抗氧化活性

2.4.1 不同产地山楂叶标准汤剂对DPPH自由基的清除能力

参考文献[19]的方法，并进行改进。将16批山楂叶标准汤剂稀释成系列浓度的溶液，以Vc溶液作为阳性对照。测定测试液对DPPH自由基清除率的方法同“2.2.4”，测完清除率后按照“2.2.6”中的方法计算IC50值。

2.4.2 不同产地山楂叶标准汤剂对ABTS自由基的清除能力

参考“2.4.1”的方法，测定测试液对ABTS自由基清除率的及IC50值。

2.5 灰关联度分析

对16批不同产地山楂叶标准汤剂HPLC指纹图谱共有峰峰面积与DPPH自由基IC50值、ABTS自由基IC50值进行灰关联度分析[17]，研究其相关性。将不同批次的山楂叶标准汤剂清除DPPH自由基活性IC50、山楂叶标准汤剂清除ABTS自由基活性IC50设为母序列，18个共有峰设为子序列共有峰分别用X1～X18表示。参考文献[18,19]方法和步骤，首先求绝对差序列，最后求关联系数并计算关联度，其中分辨系数选取0.5。

2.5.1 排关联顺序

将18个子序列对同一母序列的关联度按大小顺序排列起来,便组成关联序，记为x，它直接反映各个子序列对母序列的“贡献”的大小。据此可寻找指纹图谱共有峰对应的化学成分与抗氧化活性间的联系。

2.5.2 谱效相关性分析

对山楂叶标准汤剂HPLC指纹图谱中各共有峰峰面积数据与抗氧化活性进行灰色关联度及关联序分析。依据相对关联度的大小，确定了各成分对抗氧化作用贡献的大小顺序。

3 实验结果

3.1 山楂叶标准汤剂指纹图谱结果

16批山楂叶标准汤剂指纹图谱相似度除S1、S3批次外均大于0.94，共标记18个共有峰，见图3。通过对照品及保留时间对对照图谱中的色谱峰进行指认，指认出5个共有峰为绿原酸(6号峰)、牡荆素葡萄糖苷(11号峰)、牡荆素鼠李糖苷(12号峰)、芦丁(13号峰)及金丝桃苷(14号峰)，见图1和图2。

图1 混合对照品溶液的HPLC图谱

图2 山楂叶标准汤剂指纹图谱共有模式

图3 山楂叶标准汤剂HPLC指纹图谱色谱叠加图

3.2 不同产地山楂叶标准汤剂对DPPH自由基的清除能力结果

16批山楂叶标准汤剂对DPPH自由基的清除能力结果结果见表3和图4。

表3 16批山楂叶药材标准汤剂对DPPH自由基的清除率和半抑制率

续表3(Continued Tab.3)

编号No.生药浓度Crudedrugconcentration(mg/mL)清除率Clearance(%)IC50(mg/mL)编号No.生药浓度Crudedrugconcentration(mg/mL)清除率Clearance(%)IC50(mg/mL)258.230.6762.913.1364.150.7870.796.2568.841.5676.35S60.2511.080.84S150.2022.131.050.3921.920.3930.180.5029.210.7833.930.6741.061.0048.480.7851.691.2553.721.2571.141.5673.42S70.3922.392.34S160.2032.250.360.7833.910.2538.001.5645.610.3957.062.0051.660.5066.223.1370.130.6776.656.2573.100.7878.15S80.3919.003.101.0028.741.2533.191.5637.773.1356.536.2574.82

图4 16批山楂叶药材标准汤剂对DPPH自由基清除能力的比较

3.3 不同产地山楂叶标准汤剂对ABTS自由基的清除能力结果

16批山楂叶标准汤剂对ABTS自由基的清除能力结果见表4和图5。

表4 16批山楂叶药材标准汤剂对ABTS自由基的清除率和半抑制率

续表5(Continued Tab.5)

编号No.生药浓度Crudedrugconcentration(mg/mL)清除率Clearance(%)IC50(mg/mL)编号No.生药浓度Crudedrugconcentration(mg/mL)清除率Clearance(%)IC50(mg/mL)0.2525.050.3938.750.3938.390.5045.210.5045.680.6751.230.6748.280.7867.570.7874.571.5687.18S70.2011.781.05S160.1725.790.250.3922.750.2042.450.5026.450.2554.850.7845.010.3976.161.2553.430.5084.531.5674.120.7889.3S80.3918.961.670.5025.650.7836.331.2548.641.5662.286.2591.96

图5 16批山楂叶药材标准汤剂对ABTS自由基清除能力的比较

3.4 灰关联度结果

DPPH自由基：X11>X17>X12>X13>X10>X4>X18>X16>X7>X9>X3>X5>X2>X15>X1>X14>X6>X8。根“2.3”指认的对照品，确立牡荆素葡萄糖苷>牡荆素鼠李糖苷>芦丁>金丝桃苷>绿原酸，关联度数据见表5。

ABTS自由基：X4>X17>X11>X13>X12>X10>X18>X7>X9>X3>X5>X6>X2>X15>X16>X1>X14>X8。根据“2.3”指认的对照品，确立牡荆素葡萄糖苷>芦丁>牡荆素鼠李糖苷>金丝桃苷>绿原酸，关联度数据见表6。

表5 山楂叶标准汤剂指纹图谱与DPPH自由基抗氧化活性关联度

表6 山楂叶标准汤剂指纹图谱与ABTS自由基抗氧化活性关联度

4 讨论

4.1 色谱条件的优化

本试验进行了色谱柱、流动相检测波长等条件的优化。其中考察了色谱柱Agilent ZORBOX-SB C18及Agilent Extend C18；考察了0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)和0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)-四氢呋喃(C)；并考察了280及320 nm检测波长，最终确定了色谱柱Agilent Extend C18、320 nm波长、0.2%甲酸水(A)-乙腈(B)梯度洗脱，样品分离效果较好，样品峰较多且基线较平稳。

4.2 山楂叶标准汤剂指纹图谱结果分析

由表7相似度结果可得除S1和S3批次外各批次山楂叶标准汤剂相似度均大于0.94。结合课题组前期对16批次山楂叶标准汤剂指纹图谱主成分及聚类分析结果，可将16批样品分成两类：S1和S3批次为一类，其他批次为另一类。

表7 相似度分析结果

4.3 山楂叶标准汤剂对DPPH、ABTS自由基抗氧化活性分析

以Vc作为阳性对照，通过图3，4显然可见，河北保定(S2)、辽宁(S6)、安徽亳州(S11)、河南禹州(S14)、山东临沂(S15)和山西运城降县(S16)的IC50值较小，即这些产地的山楂叶药材标准汤剂抗氧化活性较高，而山东泰安(S1)、河北博野(S3)的IC50值为3.21和1.94，其IC50值为最高，此产地山楂叶药材的标准汤剂对DPPH和ABTS自由基的清除能力最弱，抗氧化活性也就最低。16批不同产地山楂叶标准汤剂指纹图谱分析结果与其抗氧化活性一致，即S2、S4～S16批次相似度较高且抗氧化活性高，后续可对S2、S4～S16批次山楂叶标准汤剂进行进一步讨论。S1和S3批次在HPLC色谱图表现为同其他批次相比峰多且高；在供试品颜色方面表现为绿色；在化学成分方面可能与其抗氧化活性相关。山楂叶作为一种常用药材，分布范围极为广阔，北到内蒙古，南至广西，产地的不同，其光照、海拔、温度、湿度、土壤等生态因素也会存在较大的不同，可能会导致其有效成分的药效和含量存在一定的差异。山楂叶标准汤剂抗氧化活性较强可能与其黄酮结构有关，黄酮类化合物的抗氧化作用主要通过直接捕捉和清除氧自由基来实现,另外其抗氧化活性也与调节和提高体内抗氧化酶活性相关。本文对16批不同产地的山楂叶药材标准汤剂的体外抗氧化作用进行了初步研究，可山楂叶药材的质量分析评价、谱效关系研究等提供参考依据。

4.4 灰关联分析结果

本文考察了山楂叶标准汤剂指纹图谱与其抗氧化活性的相关谱效关系，山楂叶标准汤剂HPLC指纹图谱中相似度数据与DPPH自由基、ABTS自由基抗氧化活性结果大致相似，16批山楂叶标准汤剂指纹图谱共有峰对DPPH自由基与ABTS自由基的IC50值的相对关联度均大于0.720。

前期考察了偏最小二乘法、多元线性回归分析等数据分析方法，结果均不理想。而灰关联度分析作为常用的谱效关系研究方法，是一种适用于系统信息较少的多因素分析方法，能够较大程度上体现各成分间的相互作用。通过对山楂叶标准汤剂指纹图谱共有峰峰面积及IC50值相关度进行排序，所需样本量及计算量较小，且分析结果准确度高。灰关联度分析结果可以说明山楂叶标准汤剂抗氧化活性是多组分共同起作用。其中牡荆素葡萄糖苷作用最强，可能与其羟基连接位置相关。

本文将山楂叶标准汤剂化学分析及体外活性结合，从谱效关联性角度，为山楂叶标准汤剂的质量控制提供科学依据。