菝葜醇提物对小鼠脂肪代谢酶的影响

李 欣，潘永芳，王 娜，杨丽聪，郑国栋

（江西农业大学 食品科学与工程学院，江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西 南昌330045）

【研究意义】肥胖是指一定程度的明显超重与脂肪层过厚，是体内中性脂肪过多积聚的表现。肥胖是一种典型慢性代谢疾病，它不仅影响人的体形，也与一些疾病有密切相关，如冠心病、高血压、2型糖尿病、高血脂等[1-3]。随着国民生活水平不断提高，饮食习惯的日趋欧美化，我国肥胖症发病率呈逐年上升。因此，肥胖已经成为了一个国民关注的健康问题，预防与治疗也受到越来越多人的重视。目前，肥胖的治疗最常用的方法是服用化学合成的减肥药，长期服用不仅效果不理想，而且会对人体产生一定的副作用。因此，研究人员开始研究具备减肥功能且毒副作用低的天然产物，可通过日常饮食达到预防和治疗肥胖的效果。【前人研究进展】菝葜（Smilax chi na L.），百合科菝葜属植物，生长于海拔2 000 m以下的丘陵、河谷或山坡上，在我国的长江以南广泛分布[4]。菝葜入药的历史悠久，古代医药书籍，如《名医别录》、《本草纲目》、《本草逢原》和《神农本草经疏》等书籍也都有记载。菝葜的全株均可入药，有疔疮痈肿，解毒散瘀祛风利湿等功效[4]。从现代药理方面的研究证明菝葜有抗肿瘤、降血糖、抗炎、抑菌等效果[5-7]。然而菝葜在减肥方面的研究还很少被报道。【本研究切入点】笔者用菝葜粉末喂养小鼠16周，发现菝葜粉末能显著的减少小鼠的体质量增加和腹腔内脂肪组织（IPAT）质量，表明菝葜具有一定的减肥降脂性能[8]。但是菝葜什么组分有调节脂肪代谢还不清楚，其作用机制又如何？因此本研究通过乙醇提取菝葜，分析菝葜醇提物（SCE）中的活性物质，并将0.25%，0.50%和1.00%的SCE添加到饲料中投喂小鼠，测定小鼠体质量增加变化、IPAT质量、肝脏中脂类代谢相关酶的指标。【拟解决的关键问题】SCE降脂减肥作用有哪些组分构成，能否通过AMPK，促进脂类代谢，达到减肥作用。

1 材料与方法

1.1 动物及饲料

50只体质量约20 g雌性ICR小鼠（湖南斯莱克景达实验动物有限公司），许可证号：SCXK（湘）2011-0003。菝葜购于南昌药店（产地：安徽亳州市）。

饲料配制：SCE与高脂粉末饲料进行混合，配制成0.25%，0.50%和1.00%SCE混合饲料。

主要试剂：没食子酸、芦丁、薯蓣皂苷、绿原酸、白藜芦醇、落新妇苷、黄杞苷等标准品购自上海同田生物技术有限公司；小鼠酰基辅酶A氧化酶（ACO、肉碱脂酰转移酶（CAT）、脂肪酸合成酶（FAS）、AMP激活蛋白激酶（AMPK）的ELISA试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；ALLN、AEBSF、二硫苏糖醇、亮抑酶肽购自Sigma公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 菝葜醇提物的制备 菝葜磨粉，过60目筛，用60%的乙醇以1∶20（Kg/L）的料液比浸泡1.5 h后，用超声提取机超声提取30 min，离心收集上清液，剩余沉淀再超声提取，合并两次收集的上清液，用真空旋转蒸发仪，温度在55℃下浓缩后，放入超低温冰箱冷冻，在冷冻干燥机中冷冻干燥，得到的SCE，装入自封袋，放在干燥器中保存。

1.2.2 菝葜醇提物的检测（1）SCE的总三萜测定。称取薯蓣皂苷标准品，配成160µg/mL的工作液。用香草醛-冰醋酸法制作薯蓣皂苷标准曲线，具体参照文献[9]，Y=0.108 1X+0.001 4（R2=0.998 6），样品总三萜含量根据该标准曲线进行计算。

（2）SCE的总多酚测定。称取没食子酸标准品，配成210µg/mL的工作液。用福林酚试剂法绘制没食子酸标准曲线，具体参照文献[9]，Y=0.086 1X+0.025（R2=0.999 6），样品总多酚含量根据该标准曲线进行计算。

（3）SCE中总黄酮的测定。称取芦丁标准品，配成320µg/mL的工作液，用硝酸铝法绘制没食子酸标准曲线，具体参照文献[9]，Y=0.012 3 X-0.003 3（R2=0.999 1）样品总黄酮含量根据该标准曲线进行计算。

（4）SCE成分的HPLC测定。用Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪分析SCE中的多酚成分含量。测定方法根据潘永芳[9]进行。

1.2.3 动物饲养及解剖 50只雌性ICR小鼠适应性喂养7d后，随机分成5组，对照组、高脂组、高脂添加0.25%、0.50%及1.00%SCE饲养8周，饲养期间自由采食和饮水，每周称量一次。饲养条件：室温（24±2）℃，光暗周期12/12（08:00—20:00）。8周后，小鼠禁食12 h以上，用乙醚麻醉后解剖，摘取肝脏、IPAT并称量，然后肝脏和IPAT放在-80℃冰箱保存，直到分析为止。

1.2.4 肝脏脂肪代谢酶活性分析 肝脏匀浆参照潘永芳[9]进行。

FAS、ACO、CAT和AMPK活性根据相应的ELISA试剂盒的使用说明书进行分析[10]。

1.3 统计分析

实验数据采用以平均数±标准误表示，用DPS统计软件（Version.6.55）进行student’t-test分析，P＜0.05为差异显著。

2 结 果

2.1 SCE主要成分及几种活性成分的含量

SCE中3种组分总三萜、总多酚、总黄酮的含量分别为（14.03±0.21）%，（42.54±0.45）%，（29.69±0.37）%。SCE中的总多酚含量最高，达到42.54%。

图1显示混合标曲及SCE的HPLC图谱。经分析得，SCE中的绿原酸、落新妇苷、黄杞苷和白藜芦醇的含量 分别为（13.65±0.19）mg/g，（23.65±0.36）mg/g，（7.97±0.03）mg/g，（7.46±0.15）mg/g。

图1 混合标曲（A）与SCE（B）HPCL图谱Fig.1 Chromatograms of standard mixture（A）and SCE（B）

2.2 小鼠体质量、腹腔脂肪质量变化

SCE对小鼠初始体质量、最终体质量、腹腔脂肪系数及肝脏系数的影响如表1所示。与高脂组相比，SCE投喂4周后，0.50%和1.00%SCE的小鼠体质量增加量显著减少。0.50%以上SCE投喂小鼠的腹腔脂肪系数明显低于高脂组。各组小鼠肝脏系数均无显著差异。综上可知，0.50%以上SCE可能主要是通过降低小鼠腹腔内脂肪沉积，减少体质量增加。

2.3 小鼠肝脏脂类代谢相关酶活性的变化

表2是SCE对小鼠肝脏中脂类代谢酶活性的影响。与高脂组相比，1.00%SCE投喂的小鼠肝脏中CAT和ACO活性显著提升，0.50%和1.00%SCE小鼠肝脏中AMPK活性明显提高。而各组小鼠FAS活性均无显著差异。

2.4 小鼠肝脏脂类代谢相关酶基因表达的变化

图2为SCE对小鼠肝脏及IPAT的脂类代谢相关酶基因表达的影响。与高脂组相比，1.00%SCE小鼠肝脏及IPAT中AMPK、CAT和ACO的mRNA表达量显著增加。而各组小鼠肝脏及IPAT中FAS活性均无显著差异。这些结果表明SCE增加小鼠的CAT、ACO和AMPK的基因表达量，并提高它们的活性，促进脂肪的氧化，减少脂肪沉积。

表1 SCE对小鼠体质量、腹腔内脂肪及肝脏指数的影响Tab.1 Effects of SCE on body weight，intraperitioneal adipose tissues（IPAT）and liver indexes in mice

表2 SCE对小鼠肝脏中脂类代谢酶活性的影响（IU/mg蛋白）Tab.2 Effect of SCE on liver lipid metabolism related enzymes activity in mice（IU/mg protein）

图2 菝葜醇提物对小鼠肝脏中脂类代谢相关酶基因表达的影响Fig.2 Effect of SCE on lipid metabolism genes expression in liver and IPAT of mice

3 讨 论

前期实验中以2%、4%和8%的菝葜粉末投喂小鼠，发现4%以上菝葜明显减少小鼠的体质量增加和IPAT质量，表明菝葜有减肥功效[8]。本研究0.50%以上的SCE有减少体质量增加和IPAT。通过分析SCE中主要组分，结果发现SCE中多酚含量较高，达到42.54%。有研究报道植物多酚对高脂诱导肥胖小鼠有减肥作用[11]。因此，本研究SCE抑制体质量增加和IPAT质量可能是由于菝葜多酚类化合物引起的。

通过分析SCE对肝脏和IPAT中脂类代谢酶的影响，发现SCE喂养的小鼠中CAT、ACO和AMPK的酶活性及基因表达量显著提升。研究显示苦瓜通过激活肝脏和肌肉的CAT酶的活性，增加脂肪氧化，减少大鼠体内脂肪积累[12]。研究表明上调小鼠肝脏中AMPK的基因表达，从而促进ACO、CAT的mRNA表达，提升ACO和CAT的活性，抑制脂肪沉积，减少体质量增加[13-14]。在本试验中，0.50%以上的SCE显著增加小鼠肝脏中ACO及CAT的活性及mRNA表达量，从而促进小鼠体内的脂肪酸β-氧化，减少脂肪沉积。

AMPK是一个重要的蛋白激酶，能调节机体的代谢和能量需求，在调控体内能量代谢中起着非常重要的作用[15]。激活AMPK抑制合成代谢，促进分解代谢途径开启，是体内主要的能量传感器[16]。研究表明，激活AMPK提高HSL活性，促进脂肪分解代谢[17]；增加ATGL蛋白表达水平，抑制体内脂肪积累[18]；抑制细胞葡萄糖摄入和脂肪合成[19]。激活AMPK促进磷酸化ACC和HMG-CoAR，抑制它们活性，从而减少脂肪酸和胆固醇的合成[20,21]。有研究报道用黄连素喂养小鼠，发现小鼠肝脏质量减少，血清和肝脏中脂类含量降低，预防肥胖效果，这些结果表明黄连素可以通过激活AMPK来达到减肥作用[22]。二甲双胍（一种降糖药剂）能提高胰岛素敏感性的同时，还能通过激活AMPK促进机体能量代谢、减少脂肪积累，抑制体质量增加[23]。AMPK的激活还可以通过上调CAT的基因和蛋白表达来促进脂肪酸的氧化[24]。因此，AMPK的激活可调控脂类代谢相关酶的基因和蛋白表达。

综上所述，本研究结果表明SCE减肥作用可能是由菝葜多酚类化合物引起的，其通过提升AMPK mRNA的表达量，调节小鼠肝脏和脂肪组织中的CAT和ACO的活性及基因表达水平，促进脂肪氧化，从而减少小鼠体内脂肪蓄积，降低体质量增加。