克氏原螯虾WSD的PCR诊断及组织病理损伤研究

熊关庆，杨玉涔＊，冯 杨，杨世勇*，黄小丽*，汪开毓，苗 懿，刘 钊，段 靖，赵仲孟

（1.四川农业大学 动物科技学院，四川 成都611130；2.四川农业大学 动物医学院，四川 成都611130）

【研究意义】克氏原螯虾（Pr ocamb arus clar kii）俗称“小龙虾”，属节肢动物门（Arthropoda）、甲壳纲（Malacostraca）、十足目（Decapoda）、螯虾科（Cambaridae）、原螯虾属（Pr ocamb arus）[1]。原产美国南部和墨西哥北部，我国于20世纪90年代引进并在全国大部分地区推广养殖[2]。近年来，克氏原螯虾在我国养殖产业中迅速发展，已成为一种特色化、规模化的特种养殖品种。随着克氏原螯虾养殖业集约化和规模化的发展，疾病问题也日益凸显，严重威胁着该品种的持续健康发展。目前已报道的克氏原螯虾病原包括：澳洲红螯螯虾肝胰腺呼肠孤样病毒（cherax quadricarinatus hepatopancreatic reo-like virus，CqHRV）、澳洲红螯螯虾杆状病毒（cherax quadricarinatus bacilliform virus，CqBV）、贵族螯虾杆状病毒（astacus astacus bacilliform virus，AaBV）、白斑综合症病毒（white spot syndrome virus，WSSV）等[3]，其中WSSV的危害尤为突出。【前人研究进展】WSSV是一种危害极大的杆状病毒，该病毒主要感染水生甲壳类动物，包括中国对虾（P.ch inensis）、墨吉对虾（P.merguiensis）、长毛对虾（P.penicil l at us）等在内的多种对虾均可感染[4]。1992年首次在中国台湾地区发现养殖的对虾感染白斑病毒[5]，到1994年已经扩展到全亚洲的对虾养殖地区，1999年到达美国中部和南部，2001年欧洲和澳洲地区也相继有关于对虾感染WSSV的报道[6]。WSSV不仅易感对虾，感染途径亦很简单，采用投喂和浸泡两种方式均能感染，并造成其患病死亡[7]。通常对虾感染WSSV后7～10d死亡率可达到100%，临床表现为体表暗红，发病初期头胸甲上出现少量白色斑点[8]，严重时白色斑点连接成片，且肠胃中空[9]。此外，WSSV亦能感染螃蟹和克氏原螯虾[10]，有相关研究表明，WSSV在淡水克氏原螯虾体内增殖和感染的特性与对虾极其相似[11]。近年来，包括浙江[12]、湖北[13]和江苏[14]等我国大部分地区相继出现WSSV感染克氏原螯虾的报道，鉴于该病毒的严重危害程度，2009年被农业部《一、二、三类动物疫病病种名录》列为水生生物一类动物疫病病毒[15]。【拟解决的关键问题】2018年5月，四川某克氏原螯虾养殖场出现以摄食减少、活力降低、体色变暗为主要症状并伴有大规模死亡的暴发性疾病，发病率和死亡率达50%以上，给养殖户造成了巨大的经济损失。为了找到该病的发病原因及病理损害特点，本研究对发病克氏原螯虾进行临床症状观察，并通过PCR检测、系统发育树分析，来推测本次患病克氏原螯虾的病原；同时，结合组织病理学技术检测各组织病理损伤程度，拟确定该病主要损伤靶器官，并分析致病原因，旨在为WSSV的诊断提供参考借鉴。

1 材料方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 病虾来自四川某克氏原螯虾养殖场，送检时仍存活。

1.1.2 实验试剂 甲醛溶液，冰乙酸，100%乙醇，二甲苯，琼脂糖，苏木精-伊红染色液，DNA提取试剂盒（成都擎科梓熙生物技术有限公司）等。

1.2 剖检观察及病料采集

将患病克氏原螯虾冰冻麻醉后剖检。首先进行体表完整性及体表症状观察，接着打开头胸甲，观察鳃，肝胰腺等大体病变情况，并迅速采集鳃、心脏、肝胰腺、胃肠道和腹节肌肉，分别取少量组织用液氮快速冻存后放入-80℃条件下保存，剩余组织放入AFA固定液中保存。

1.3 患病虾体内WSSV的PCR检测

根据大体病理观察推测出患病虾的病变由感染WSSV引起，通过PCR检测鉴定，参照何琪瑶[16]等设计的引物（表1）利用套氏PCR方法检测克氏原螯虾WSSV。将-80℃保存的鳃、心脏、肝胰腺、肌肉组织混合后用液氮快速研磨，研磨至粉末状后参照DNA提取试剂盒说明书快速提取患病克氏原螯虾组织DNA，先用外套引物进行第一步PCR扩增。PCR扩增体系：12.5µL 2×Ta q Master Mix，上、下游引物各1µL，加入模板2µL，8.5µL ddH2O。扩增条件：94℃10 min，94℃1 min，55℃30 s，72℃2 min，30个循环；72℃7 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。接着将扩增产物10倍稀释后用内套引物进行第二步PCR扩增，第二步PCR扩增产物处理同上一步，PCR产物由成都擎科梓熙生物技术有限公司测序，将测序结果在GenBank上进行BLAST比对。

表1 检测WSSV的引物Tab.1 Detection of primers for WSSV

1.4 WSSV的遗传进化分析

将测序结果通过NCBI的BLAST查找同源性序列，利用DNAMAN进行序列编辑和比对分析，此外，利用MEGA7.0邻近法构建系统进化树。

1.5 患病虾组织切片制备及病理损伤观察

将AFA液固定的鳃、心脏、肝胰腺、肠道、腹节肌肉和眼睛取出，鳃、腹节肌肉和眼睛用脱钙液脱钙5 h，接着水洗过夜，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋、切片（3µm），苏木精-伊红（H&E）染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察组织病理损伤，并拍照记录。

2 结 果

2.1 患病虾的临床症状和解剖特征

患病克氏原螯虾主要临床症状为体色变暗、摄食减少、活力较差（图1A）。剖解后发现，病虾内脏器官大体病变不典型，主要表现为部分肠段中空无食物，肠壁透明，肠管较细（图1B-C）；其余器官如肝胰腺、鳃等无明显变化。

2.2 患病虾PCR检测结果

将-80℃保存的鳃、肝胰腺、肠道和肌肉进行混合匀浆，提取混合组织的DNA，用WSSV外引物进行PCR扩增，经1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，所有样品均扩增出一条1 447 bp的特异性条带（图2A）。接着使用WSSV内引物对样品进行套氏PCR检测，所有样品均扩增出一条约940 bp的条带（图2B）。套氏PCR产物经成都擎科梓熙生物技术有限公司进行序列测定后，获得长度为941 bp的序列。通过BLAST比对，显示该序列与GenBank中WSSV有100%的同源性，确定本次患病克氏原螯虾体内检测病毒为WSSV阳性。

图1 患病虾临床特征Fig.1 Clinical characteristics of diseased shrimp

图2 PCR检测WSSVFig.2 PCR detection of WSSV

2.3 患病虾遗传进化分析结果

将测定序列结果分别命名为xgq-1、xgq-2和xgq-3，用MEGA7.0软件构建系统进化树（图3）。结果显示，该基因序列与WSSV聚为一簇，与印度株（MH883318.1）、墨西哥株（MG432482.1）和中国株（KX686117.1）等序列同源性为100%，进一步确认患病克氏原螯虾体内携带有WSSV。

2.4 患病虾组织病理观察

经组织病理学观察发现患病虾各组织存在如下病变。

肝胰腺：患病克氏原螯虾肝胰腺组织结构松散，但管腔结构仍然存在，分界较明显。低倍下可见肝小管管腔扩张，星型结构消失，部分肝细胞坏死、崩解，使肝小管断裂，残缺（图4A）；高倍下可见间质有不同程度炎性细胞浸润（图4B），此外还可见部分肝细胞胞核染色质浓缩，胞核崩解、碎裂（图4C）。表现为中度至重度坏死性肝胰腺炎，

鳃：可见鳃丝及鳃小片血腔严重扩张，充盈（图4D）；鳃丝入鳃动脉和出鳃动脉内均可见大量炎性细胞（图4E）；高倍下可见柱细胞极度肿胀，少量坏死（图4F）。表现为中度充血性鳃炎。

心脏：有大量炎性细胞浸润，部分区域嗜碱性染色增强（图4G）；高倍下可观察到大量坏死细胞及少量嗜酸性粒细胞（图4H）。表现为中度坏死性心肌炎。

肠道：可在黏膜下层见到呈团分布的炎性细胞，其余病理变化不典型（图4I）。肠道表现为轻度肠炎。其他组织器官无明显组织病理表现。

图3 WSSV的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of WSSV

图4 患病虾组织病理学表现Fig.4 Histopathological manifestations of diseased shrimp

3 讨论与结论

目前，WSSV检测方法较多，需筛选一种较为简捷且准确度高的方法。套式PCR检测法[17]是一个检测WSSV的国家标准，是一种使用两对PCR引物扩增完整的片段的方法，与其他方法更具敏感性高、特异性高等优点[18]。李文杰[19]等利用套氏PCR检测克氏原螯虾WSSV，结果显示该方法检测极限达到36 pg，比一步PCR灵敏度提高了1 000倍。本研究采用套氏PCR检测方法，利用外引物扩增出1 450 bp左右的序列，将第一轮PCR反应产物作为内引物扩增的模板，最终得到一条约940 bp的序列，通过BLAST比对及系统发育进化树分析，确定本次患病克氏原螯虾为WSSV阳性。

组织病理学诊断法亦是判断白斑综合征（white spot disease，WSD）的重要方法，由于WSD组织病理学研究起步较晚，且主要以研究对虾为主，目前关于克氏原螯虾感染WSD的组织病理学研究相对缺乏、水平不高，由于病变特征不明，攻击靶器官不清，阻碍了对该病发病机制的深入理解。建立完善的组织病理变化标准，以期为克氏原螯虾WSSV的鉴定提供参考。本研究中患病克氏原螯虾表现为明显的中度至重度坏死性肝胰腺炎、中度充血性鳃炎、以及轻度肠炎，与魏克强[12]及何琪瑶[16]报道的一致，但未发现骨骼肌组织病变，却观察到患病虾出现中度坏死性心肌炎。心脏是脊椎动物循环系统中的动力，是维持机体正常的代谢和功能的重要器官，一旦出现病变，对机体危害极大，这可能是造成患病克氏原螯虾死亡的主要原因。本次观察到克氏原螯虾感染WSSV后心脏出现严重的病变，这在之前还未有相关报道。因此，最终确定WSSV主要靶器官为肝胰腺、心脏、鳃和肠道，为WSD组织病理学诊断法提供重要的参考价值。

近年来，克氏原螯虾需求大增，市场往往供不应求，进一步刺激了该品种的扩张性养殖。因此，对养殖过程中疾病的控制尤为重要。WSSV对水生甲壳类动物危害极大，是克氏原螯虾养殖过程中的主要威胁。疫苗是病毒病的防治最有效的手段，目前，已研制出多种抗WSSV疫苗，魏克强[20]、Jeroen[21]等制备出抗WSSV的重组VP28蛋白疫苗，并通过实验证明疫苗对克氏原螯虾抗病毒有一定的保护作用；卢亚楠等[22]还制备了WSSV的3种外壳蛋白VP28、VP19、VP15基因疫苗的特异性卵黄抗体，疫苗处理后克氏原螯虾存活率达到80%以上。虽然目前研制的疫苗在实验室范围内体现了良好的抗WSSV保护作用，但离生产应用还有很长的路要走，使用更为方便的口服疫苗将是控制WSD的重要方向。此外，研究发现WSSV既能横向传播，亦可垂直传播[23]，且只有当水环境中病毒浓度达到一定程度才能造成感染，大部分发病区域是由于水质变差给病毒的感染创造了有利的条件。因此，在生产中，应该随时监测水质情况，一旦恶化及时调理或换水；此外，虾苗的繁殖也要重视，大部分养殖户虾苗来自于上年塘中剩余亲虾，自产虾苗需要进行抽样监测，如有发现病毒感染，及时淘汰，从源头上控制。本研究通过对克氏原螯虾WSD的诊断及组织病理损伤研究，为生产中WSD的鉴定提供一个较为完整的参考模型。