杨萍,黄惠勇,李丰
癫痫发作系脑部神经元高度同步化异常放电所导致,以反复发作性、短暂性、刻板性的中枢神经系统功能失常为特征,严重威胁人类身心健康[1]。癫痫的发病机制复杂,主要与离子通道、遗传、神经递质、细胞因子及免疫、神经胶质细胞等关系密切[2]。细胞焦亡(Pyroptosis)是近年发现并证实的一种伴随着炎症反应的细胞程序性死亡方式[3]。核苷酸结合寡聚化结构域(Nucleotide-binding Oligomerization Domain,NOD)样受体蛋白3(NOD-Like Receptor 1,NLRP3)炎症小体,因在癫痫、动脉粥样硬化、阿尔茨海默病等多种疾病无菌性炎症反应中发挥重要作用而备受关注[4]。研究发现,当各种内源性或外源性刺激激活NLRP3炎症小体后,NLRP3分子通过伴侣蛋白ASC 的作用与Caspase-1 的前体Pro-Caspase-1 结合成大分子结合物,Pro-Caspase-1激活并水解掉自身的一个小片段成为Caspase-1,Caspase-1蛋白活化并产生有生物活性的白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-18[5],从而介导炎症反应。那么NLRP3 介导炎症反应如何影响癫痫形成与发展?本研究采用氯化锂-匹罗卡品癫痫模型,对不同时间点大鼠血清采用ELISA 检测IL-1β、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)蛋白含量,采用免疫组化及RT-PCR 方法检测海马齿状回的NLRP3、Caspase-1 表达,来阐明NLRP3在匹罗卡品致癫痫大鼠模型的作用。
1.1.1 实验动物 清洁级成年雄性SD 大鼠64 只,体质量为(200±20)g,购自湖南中医药大学实验动物中心,动物合格证号:SYXK[湘]2016-0005。
1.1.2 主要试剂与设备 BX43 型双目生物摄像显微镜购于日本Olympus 公司;F50 酶标仪购于瑞士Sunrise 公司;JY92-IIN 超声仪购于宁波新芝公司。匹罗 卡 品(ab141301)、Caspase-1(ab1872)购 于 美 国Abcam 公司,氯化锂(1001011078)购于美国Sigma 公司,阿托品(H12020382)购于天津金耀有限公司,NLRP3(BM4490)购于武汉博士德生物工程有限公司,ELISA 试剂盒购于上海哈灵生物有限公司,PCR 引物购于生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2.1 分组及模型制备 随机选择12只为对照组,其他大鼠进行造模,造模后随机分为1 d、7 d、14 d、28 d组4 组,每组12 只。其余大鼠为补充性饲养。参照文献[6]采用氯化锂-匹罗卡品诱导癫痫模型,大鼠腹腔注射氯化锂3 mEq/kg,18 h后再给予匹罗卡品30 mg/kg,注射匹罗卡品前30 min 注射阿托品l mg/kg 以拮抗外周胆碱能作用,若30 min 内无惊厥发作,可按每次10 mg/kg 追加匹罗卡品,追加达4次仍未达到Ⅳ级发作则不再追加。侧卧位送回鼠笼。达到癫痫持续状态后40 min 给予地西泮4 mg/kg 和10%水合氯醛3 mL/kg,终止发作。选择Racine Ⅳ级以上并存活者入组。造模后各组均以生理盐水1 mL/d灌胃。
1.2.2 组织取材 每组各取6只在相应的时间点(1 d、7 d、14 d、28 d)将动物麻醉,经左心室抽取动脉血5 mL用于ELISA。然后心脏灌注固定,取脑,去首尾两端,保留海马部分,放入4%多聚甲醛溶液中固定72 h 后,组织脱水,石蜡包埋制成石蜡切片用于免疫组化。剩余大鼠麻醉后处死,将其右侧海马立即在冰上解剖分离,保存于-80 ℃,用于RT-PCR。
1.2.3 ELISA检测血清IL-1β、TNF含量 按重量(g):体积(mL)=1∶9的比例,加入9倍体积的生理盐水,超声匀浆,3 000 rpm 离心10 min,取上清进行蛋白定量。调整各管蛋白含量400 μg/mL,用于下一步ELISA。ELISA 测得各管的OD 值,通过标准品提供的回归方程,转化成各管IL-1β、TNF的相对含量。
1.2.4 免疫组化检测海马组织NLRP3、Caspase-1 表达 ①脱蜡;②加入1%H2O210 min,0.01 mmol/L PBS漂洗5 min×3;③5% BSA+0.3%TritonX-100 室温下封闭l h;④0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3,滴加兔抗鼠一抗NLRP3、Caspase-1(1∶100);⑤4 ℃过夜。⑥0.01 mol/L PBS 漂洗5 min×3,加入二抗(1∶200),37 ℃孵育l h;⑦0.01 mol/L PBS 漂洗5 min×3,加入ABC 复合物,37 ℃孵育l h;⑧0.01 mol/L PBS漂洗5 min×3,DAB显色试剂盒37 ℃显色5 min;⑨苏木素复染,二甲苯透明15 min,中性树胶封片。计算右侧海马齿状回光密度值。
1.2.5 RT-PCR 检测海马组织NLRP3、Caspase-1 表达用Triziol法提取总RNA,用反转录酶将mRNA反转录为cDNA。构建聚合酶体系;Taq酶催化,热循环:95 ℃预热5 min,40个循环(94 ℃20 s,退火20 s,72 ℃30 s)。采用荧光实时定量PCR 法,将阈值循环数(ct)值与不同浓度标准品的对数值拟合作图,得出校正曲线;通过2-△△ct法计算目的基因与内参物(β-actin)Ct 值的差值,表示目的基因的相对表达水平。Caspase-1 上游引物5’-GTACACGTCTTGCCCTCATTAT-3’,下游引物5’-GCAGCAGCAACTTCATTTCTC-3’;NLRP3 上游引物5’-TCACCCAAGGAGGAAGAAGA-3’,下游引物5’-GTCTGGAAGAACAGGCAACA-3’;β-actin 上游引物5’-AGGGTGGTGGACCTCATGG-3’,下游引物5’-AGCAACTGAGGGCCTCTCTCTT-3’。
采用SPSS24.0 软件进行统计分析,计量结果以(±s)表示,所有数据均进行正态性、方差齐性检验,方差齐采用LSD 多重比较法,若方差不齐采用Dunnett T3,不满足正态检验则使用秩和检验。P<0.05 为差异有统计学意义。
ELISA 结果显示,7 d、14 d、28 d 组血清中IL-1β、TNF 含量的含量较对照组增高,有显著性差异(P<0.01),1 d 组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),28 d 组的IL-1β、TNF 含量均高于其他组(P<0.01),见表1。
免疫组化结果显示,大鼠海马齿状回细胞质可观察到棕色或者棕褐色颗粒,为NLRP3、Caspase-1 阳性表达。7 d、14 d、28 d 组海马齿状回NLRP3、Caspase-1平均光密度较对照组高,差异有统计学意义(P<0.01),1 d 组与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。且28 d组NLRP3、Caspase-1 阳性表达均高于其他组(P<0.01),见表1、图1、图2。
RT-PCR 结果显示,7 d、14 d、28 d 组海马组织NLRP3、Caspase-1 mRNA 较对照组高,差异有统计学意义(P<0.01),1 d 组与对照组相比无统计学意义(P>0.05),28 d 组NLRP3、Caspase-1 mRNA 均高于其他组(P<0.01),见表1。
锂-匹罗卡品诱导的癫痫发作形式很接近人类慢性颞叶癫痫特征,造模28 d 左右动物将出现癫痫自发性发作,因此氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫模型已被广泛用于动物科研[7]。研究证实海马齿状回在癫痫神经发生中起关键作用[8],笔者前期研究也发现慢性癫痫合并抑郁大鼠新生神经元减少[9]。Chugh 等[10]发现癫痫小鼠炎症因子表达增加影响海马齿状回神经发生。实验发现炎症反应与癫痫的发作及复发有密不可分的关系[11,12],脑内海马区的炎症反应可降低痫性发作的阈值、增加神经元兴奋性、破坏血脑屏障、介导神经元死亡及突触重塑[13]。目前已经发现多种炎性介质在癫痫患者或动物模型中表达升高,其中IL-1β与癫痫的发生发展密切相关。动物实验已证实抑制IL-1β合成能降低癫痫的发病率及复发率,而IL-1β升高又能加剧痫性发作以及降低癫痫发作阈值[14]。选择性阻断,或敲除Caspase-1,能显著减少癫痫发作[15]。
表1 各组大鼠血清IL-1β、TNF及海马组织NLRP3、Caspase-1含量比较
注:与对照组比较,①P<0.01;与1 d组比较,②P<0.01;与7 d组比较,③P<0.01;与14 d组比较,④P<0.01
笔者使用氯化锂-匹罗卡品诱导的癫痫模型,采用ELISA 检测血清IL-1β、TNF 蛋白含量,发现痫性发作后各时间点血清IL-1β、TNF 蛋白含量明显高于对照组,且在28 d时最高,考虑癫痫形成过程中与炎症反应激活有关。张海清等[16]发现海马区NLRP3参与急性癫痫模型(0~7 d)诱导的炎症反应。NLRP3 炎性小体能使磷酸化的Caspase-1 去磷酸化,从而活化Caspase-1,促进IL-1β、IL-18炎性因子前体的成熟,因此NLRP3活化是IL-1β成熟的关键。焦亡在神经系统病变中起关键作用,且NLRP1在脑内神经元中高表达[17],并与多种神经系统疾病相关,例如感染、无菌性脑损伤及慢性神经系统疾病[18]。研究显示[19],在匹罗卡品诱发的癫痫大鼠模型中海马组织中的NLRP1、Caspase-1 明显升高,IL-1β表达增加,验证NLRP1 炎症小体依赖的焦亡参与癫痫发病过程。这些研究表明癫痫可出现细胞焦亡现象,那么在匹罗卡品诱导的慢性自发性癫痫过程中炎症激活是否与海马齿状回NLRP3 的细胞焦亡相关?本文进一步研究发现痫性发作后各时间点海马齿状回区NLRP3、caspase-1 阳性表达及海马区NLRP3、Caspase-1 mRNA明显高于对照组,在慢性自发性癫痫形成后达到顶峰,说明NLRP3与慢性自发性癫痫激活炎症因子有关。
图1 各组大鼠海马齿状回NLRP3表达(免疫组化染色,×400)
图2 各组大鼠海马齿状回Caspase-1表达(免疫组化染色,×400)
综上所述,在慢性自发性癫痫形成过程中,NLRP3可能激活Caspase-1,诱发炎症反应,从而导致癫痫反复发作。但本实验未设置阳性药物干预组进行验证,需要进一步研究。