外周血细胞外囊泡miR-191表达水平在早期非小细胞肺癌中的诊断价值分析

张王锋 尹建威

榆林市第二医院呼吸内科719000

通信作者：尹建威,Email:jw000000000@163.com

目前,肺癌已经成为全球癌症的首要死因,而非小细胞肺癌 (non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌的85%。NSCLC患者早期没有明显的临床症状,一旦出现临床症状,患者疾病已经发展到中晚期,严重影响患者的生存期[1]。早诊断对于NSCLC 的治疗至关重要。因此,寻找NSCLC的早期生物标志物已经成为研究的重点和热点[2]。细胞外囊泡是一种纳米级别的微颗粒,由细胞分泌并带有相应来源细胞生物遗传信息,可以在所有体液中稳定存在[3]。最新研究表明细胞外囊泡特异性地包含多种微小RNA (microRNA,miRNA),可作为肿瘤诊断的生物标志物[4]。研究表明miR-191在多种肿瘤存在不同程度的表达异常[5]。为了探讨外周血细胞外囊泡miR-191 表达水平在早期NSCLC 中的诊断价值,本研究对50例早期NSCLC患者进行研究,现将相关内容报道如下。

1 对象与方法

1.1 一般资料 选取2018年1～12月榆林市第二医院收治的60 例早期NSCLC 患者作为观察组,所有患者经病理诊断确诊为NSCLC。入组标准：(1)既往无肿瘤相关疾病;(2)未接受过放化疗;(3)TNM 分期为Ⅰ和Ⅱ期患者。排除标准： (1)妊娠、感染患者;(2)合并有肝肾功能不全、糖尿病的患者;(3)合并有心脑血管疾病的患者;(4)合并有其他肿瘤的患者。选取同期体检的年龄和性别匹配的60名健康者作为对照组,本研究通过榆林市第二医院伦理委员会批准 (20200089),所有患者及其家属知情后签署知情同意书。

1.2 研究方法 所有患者于入院后治疗前第2天清晨采集EDTA-K2抗凝血液标本。离心后提取血清血浆,-80 ℃保存备用。将所有患者的血浆标本室温溶解后,3 000×g,4 ℃离心15 min,以去除血浆中杂质,转移上清液到新EP管中,采用液压透析滤过法收集细胞外囊泡,并进行分离和富集,将提取的细胞外囊泡进行考马斯亮蓝蛋白定量后备用。

吸取分离纯化后的细胞外囊泡悬液加于载样铜网上,待网孔吸收干燥后,加入洗液洗涤,然后加入电镜溶液,反应10 min,并洗涤2 次,室温下干燥过夜,电镜下成像。并根据考马斯亮蓝蛋白定量结果取10μg细胞外囊泡,按照1∶1 000的比例用PBS稀释,然后采用纳米示踪技术统计细胞外囊泡的粒径和浓度。

分别采用RNA 提取试剂盒提取细胞外囊泡和血浆中的总RNA,逆转录并扩增miR-191,采用是2-ΔΔCt法计算miR-191的表达水平。

分别采用细胞角蛋白19片段 (cytokeratin 19 fragment,CYFRA21-1)、 鳞 细 胞 癌 抗 原(squamous cell carcinoma antigen,SCCA)以及癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)检测试剂盒(酶联免疫吸附测定法)分析所有患者细胞外囊泡,以校准品浓度及荧光值做成标准曲线,根据标准曲线和样本的荧光值计算样本中CEA、SCCA、CYRRA21-1表达水平。

1.3 统计学分析 本研究采用SPSS 24.0软件进行数据分析,计量资料采用x-±s 表示,采用t 检验,采用受试者工作特征 (receiver operating characteristic curve,ROC)曲线分析细胞外囊泡miR-191水平诊断效能,P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 透射电镜和纳米颗粒跟踪技术分析分离出的细胞外囊泡 利用透射电镜观察分离到的早期非小细胞肺癌患者的外周血细胞外囊泡分布情况如图1所示,大小约为40 nm,呈囊泡状分布。纳米颗粒跟踪分析结果显示纳米颗粒粒径,最大峰值为(167.6±10.3)nm,大多数颗粒的直径小于200 nm (图1),符合细胞外囊泡的粒径范围,与透射电镜的结果吻合。

2.2 2组外周血游离和细胞外囊泡miR-191水平比较 2组外周血游离miR-191表达水平数据比较差异无统计学意义 (t=1.230,P ＞0.05),观察组患者细胞外囊泡miR-191水平显著高于对照组患者,差异有统计学意义 (t =15.686,P ＜0.05),见表1。

图1 透射电镜和纳米颗粒跟踪技术分析分离出的细胞外囊泡 A：透射电镜;B：纳米颗粒跟踪技术

表1 2组患者外周血游离和细胞外囊泡miR-191相对表达水平比较(±s)

表1 2组患者外周血游离和细胞外囊泡miR-191相对表达水平比较(±s)

组别 例数 游离miR-191 细胞外囊泡miR-191对照组 60 4.3±1.0 5.1±1.1观察组 60 5.3±1.2 12.3±2.1 t值 1.230 15.686 P 值 0.248 ＜0.001

2.3 ROC曲线分析细胞外囊泡miR-191水平对早期NSCLC的诊断价值 ROC 曲线分析结果显示,细胞外囊泡miR-191水平预测早期NSCLC的曲线下面积为83.6% (P ＜0.05),95%CI：0.734～0.928。当miR-191 水平为9.7时,可得出最佳敏感度 (76%)和特异度 (84.3%),细胞外囊泡miR-191 水平的曲线下面积显著高于CEA(50.1%)、SCCA (62.1%)、CYFRA21-1 (60.0%)以及三项联合(71.5%),见图2。

2.4 早期NSCLC 患者外周血细胞外囊泡miR-191 表达水平与临床病理相关性分析 早期NSCLC患者外周血细胞外囊泡miR-191表达水平与TNM 分期有关 (t=3.126,P ＜0.05),与年龄、性别、吸烟史、病理分期及病理分型均无关(P 值均＞0.05),见表2。

3 讨论

在机体内所有细胞均分泌细胞外囊泡,但肿瘤细胞的细胞外囊泡的释放量远超正常细胞,因此,肿瘤患者外周血的细胞外囊泡绝大部分来自于肿瘤细胞,其组成成分,包括蛋白质、DNA、mRNA以及miRNA 等,与肿瘤母细胞保持高度一致性[6]。提取外周血细胞外囊泡进行相关癌症研究,为肿瘤细胞特征的分析提供了一个新的思路。在多种肿瘤进程中,miRNA 作为关键调节因子发挥作用,参与肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭、血管生成和细胞凋亡等[7]。

图2 受试者工作特征曲线分析miR-191、CEA、SCCA 以及CYRRA21-1对早期非小细胞肺癌的诊断价值

表2 早期非小细胞肺癌患者外周血细胞外囊泡miR-191表达水平与临床病理相关性分析 (x-±s)

本研究对60例早期NSCLC 的进行研究,结果显示2组外周血游离miR-191 表达水平比较差异无统计学意义(P ＞0.05),观察组患者细胞外囊泡miR-191水平显著高于健康对照组患者,差异有统计学意义(P ＜0.05)。表明外周血细胞外囊泡miR-191是NSCLC的高危预测因素。而两组患者的外周血游离miR-191数据比较差异无统计学差异。对于miRNA 而言,人体外周血的酸碱度、温度以及各种酶类等物质共同营造的环境使得大量游离miRNA 被降解,因此,外周血中游离miR-191的表达量个体差异很大,不能准确反映NSCLC患者肿瘤组织或肿瘤细胞中miR-191的表达情况[8-9]。相关研究也表明miR-191在多种肿瘤组织中呈不同程度的表达升高,并与肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移、凋亡以及细胞周期密切相关[10]。有研究表明miR-191 在NSCLC 表达水平显著升高,且与组织分化程度、淋巴结转移以及患者的生存期密切相关[11]。本研究还发现NSCLC患者外周血细胞外囊泡的miR-191的表达水平与病理分期相关,表明miR-191的表达水平随着NSCLC肿瘤细胞恶性程度的增高而升高。其机制可能是miRNA191参与诱导细胞向肿瘤细胞转化,最终导致癌症的发生,恶性程度越高的肿瘤组织及细胞,释放出更多的细胞外囊泡[12]。

目前,临床上NSCLC风险预测的有效的血清标志物包括CEA、SCCA、CYRRA21-1等[13]。本研究结果显示细胞外囊泡miR-191 水平预测早期NSCLC的曲线下面积为83.6% (P ＜0.05),显著 高 于 CEA (50.1%)、SCCA (62.1%)、CYFRA21-1 (60.0%)以及三项联合 (71.5%)。从常规上讲CEA、SCCA、CYRRA21-1可以作为NSCLC的诊断指标,但是由于在临床上实际操作起来需要复杂的运算、缺乏统一标准的诊断界点[14],此外对于早期NSCLC,这三种的诊断效能明显低于外周血细胞外miR-191 的表达水平,所以本研究推荐采用外周血细胞外miR-191 的表达水平来替代CEA、SCCA、CYRRA21-1作为早期NSCLC的诊断[15]。

综上所述,早期NSCLC患者外周血细胞外囊泡miR-191表达水平显著增高,可以作为临床检测早期NSCLC的潜在标志物之一,具有重要的临床意义。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突