不同类型大孔吸附树脂富集皂角刺总黄酮的效果研究

郑 立，耿红梅

(1.衡水市疾病预防控制中心，河北 衡水 053000；2.衡水学院 应用化学系，河北 衡水 053000)

大孔吸附树脂比表面积大、交换速度快、吸附选择性较高，不溶于酸、碱及有机溶剂，是一类比较环保的高聚物。大孔吸附树脂吸附法与溶剂萃取法、超临界CO2萃取法、膜分离法等分离技术相比，具有生产周期短、可重复使用树脂等优点，在化合物的分离中被广泛应用[1-2]。皂角刺为豆科皂荚属植物皂荚(Gleditsia sinensis Lam)的干燥棘刺，始载于《本草纲目》，2015版药典记载具“消肿托毒、排脓、杀虫的功效，用于痈疽初起或脓成不溃、外治疥癣麻风”[3]。研究表明，皂角刺含有黄酮类化合物、三萜、多糖等等多种化学成分，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、护肝等多种药理作用，临床常用于治疗癌症。皂角刺黄酮类成分是天然抗氧化剂，具较强的清除自由基的能力[4-6]。目前，国外关于皂角刺的研究很少，国内大部分研究仅限于鉴定和功效的研究[7-11]，刘爱朋等研究了皂角刺总黄酮提取工艺的优化及其抗氧化活性[12]，但有关大孔树脂纯化皂角刺总黄酮的研究未见报道。本实验选取多种不同型号的大孔吸附树脂，考察它们的吸附与解吸性能，选出对皂角刺总黄酮具有较好吸附分离性能的树脂，并优化其工艺参数，以期为皂角刺资源的开发利用提供理论依据。

1 材料与仪器

TU-1901紫外可见分光光度计(普析通用仪器公司)；THZ-82恒温振荡器(金坛市富华仪器有限公司)；SHZ-DⅢ循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)；R-201旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)；W-201B数显恒温水浴锅(上海申胜生物技术)；KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器)；FA2004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)；各种型号标准口玻璃仪器(天津玻璃仪器厂)。

皂角刺购于河北安国药材市场，经衡水市药检所孙雪主任药师鉴定为豆科植物皂角刺；SP700大孔吸附树脂(日本三菱化学公司)、AB-8、D101、S-8、D4020、NKA-9、X-5、NKA大孔吸附树脂(南开大学化工厂)；芦丁对照品(购于中国药品生物制品检定所)；其它试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 上样液制备

称取皂角刺粉末适量，加水10倍量浸泡过夜，放入索氏提取器中，采用索氏提取装置用70%乙醇溶液提取至无色，最后得到生药溶液0.2 g/mL，备用。

2.2 皂角刺总黄酮测定

2.2.1 标准曲线的绘制[9]

将芦丁对照品干燥至恒重，精称17.11 mg，于100 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，即得(每1 mL溶液中含芦丁0.171 mg)。分别用移液管精密量取该溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，于10 mL量瓶中，加0.3 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀，放6 min；加0.3 mL的10%硝酸铝溶液，摇匀，放6 min；再加4.0 mL的10%氢氧化钠溶液，用70%乙醇定容，摇匀，放15 min。以0.0 mL的标准溶液做空白，波长为510 nm，测吸光度。以芦丁浓度(X)为横坐标，以吸光度(Y)为纵坐标，得标准曲线的回归方程Y=13.2X-0.0003，r=0.9996，线性范围为17.1～85.5 μg/mL。

2.2.2 测定方法

精密量取供试品溶液0.4 mL，置10 mL量瓶中，照2.2.1项下的方法操作，在分光光度计上，在510 nm波长处测定吸光度A，平行测三次，计算总黄酮的含量为4.37%。

2.3 树脂型号的筛选研究

2.3.1 大孔树脂预处理及含水量的测定

选用多种不同型号的大孔吸附树脂进行试验(SP700、NKA-9、AB-8、X-5、S-8、NKA、D4020)。将树脂先用95%乙醇浸泡24 h，装柱后用蒸馏水洗，再用0.1 mol/L NaOH 溶液浸泡 2 h后，用水洗至pH值约为7，再用0.1 mol/L 盐酸溶液浸泡2 h后，用水洗至pH值约为7，最后用95%和蒸馏水洗至无醇，备用。取少量树脂，用干燥法测定含水量(见表1)。

2.3.2 静态吸附-解吸试验

取上述不同型号(SP700、X-5、S-8、NKA、NKA-9、AB-8、D4020)经预处理的湿树脂各1.0 g，放于具塞三角瓶中，加入25.00 mL吸附原液，在恒温振荡器上振荡24 h，吸附后过滤，续滤液用上述方法测定总黄酮的含量。并计算关于皂角刺总黄酮不同树脂的静态吸附率、吸附量。结果见表1。同时，取上述不同型号已经吸附饱和后的树脂，均加70%乙醇 25 mL，于恒温振荡器上，20℃振荡12 h，过滤后测定滤液中总黄酮含量，计算出解吸率。

吸附量 =(吸附前溶液浓度-吸附后溶液的平衡浓度)×溶液体积/干树脂重量

吸附率(%)=(吸附前溶液浓度-吸附后溶液的平衡浓度)/吸附前溶液浓度×100

解吸率(%)= 滤液中总黄酮的含量×滤液的体积/树脂的饱和吸附量×100

表1 7种树脂的静态吸附和解吸性能

结果表明：7种不同型号树脂种，SP700、S-8、AB-8的吸附容量较大，SP700、AB-8、X-5的解吸率较大。

2.3.3 静态吸附曲线的绘制

照2.3.2测定法，分别在吸附1、2、3、4、6、8、10 h，测定各树脂对总黄酮的吸附量Qt(mg/g)，以 Qt为纵坐标，以时间t为横坐标，作图，得曲线，结果见图1。从图中可以看出，SP700、AB-8、S-8型的树脂吸附性能较好。

2.4 AB-8树脂纯化皂角刺总黄酮的工艺参数考察[10]

2.4.1 上样浓度的确定

分别取0.1、0.2、0.3、0.4 g/mL的溶液10 mL，通过装有20 mL AB-8大孔树脂柱，流速2 mL/min，进行一次重复吸附，吸附完全后，先用蒸馏水将未吸附样品液洗净，再用70%乙醇洗至洗脱液中基本无黄酮。将洗脱液浓缩定容至100 mL进行测定，计算总黄酮吸附量，分别为6.33、9.52、8.98、9.12(mg总黄酮/mL树脂)，故上样液浓度选择0.2 g/mL。

2.4.2 洗脱剂的确定

取10 mL的浓度为0.2 g/mL的样品液，流速2 mL/min，分别通过AB-8树脂柱4支，均上样后进行动态吸附。先用蒸馏水洗脱树脂柱，至洗脱液接近无色，然后分别用30%、50%、70%、95%乙醇洗脱，最后至洗脱液中基本无黄酮，将洗脱液进行收集，测定总黄酮的含量，并将洗脱液蒸干、称重，计算总黄酮回收率，结果见表2。从表可以看出，70% 乙醇洗脱物中,总黄酮回收率最高，故确定70% 乙醇为最佳洗脱剂。

表2 不同洗脱剂对皂角刺总黄酮的影响

2.4.3 吸附流速的确定

取浓度为0.2 g/mL的样品溶液10 mL，分别以1、2、3 mL/min的流速通过装有20 mL的AB-8大孔树脂柱进行吸附，考察流速对树脂吸附量的影响。结果表明，吸附流速过快，树脂吸附量下降，提前泄漏；流速低，有利于黄酮的充分吸附，但会影响生产效率，使生产周期延长，成本增加。综合考虑，选择吸附流速为2 mL/min较为适宜。

2.4.4 洗脱流速的确定

取浓度为0.2 g/mL的样品溶液10 mL，以2 mL/min流速在3支AB-8树脂柱进行上样，用70%乙醇分别以1、2、3、4 mL/min的速度洗脱，将收集到的洗脱液干，称重，计算总黄酮的回收率分别为72.1%、72.0%、69.6%、62.8%，故确定洗脱速度为2 mL/min。

2.4.5 树脂重复利用次数的选择

按照上面选定的条件：上样浓度0.2 mg/mL，流速2 mL/min，用70%乙醇进行洗脱，洗脱流速2 mL/min，在同一个树脂柱上，进行上样、吸附、洗脱、收集，然后测定总黄酮的吸附量，重复试验6次考察树脂的情况。结果重复使用至第4次时，总黄酮收率明显减低，树脂颜色变绿明显，需要进行再生处理。故树脂可重复利用3次。

3 讨论

从七种大孔吸附树脂对皂角刺总黄酮的吸附容量、吸附率、解吸率、吸附动力学曲线等研究发现，不同类型的树脂对皂角刺总黄酮的吸附能力和解吸能力各有差别，测定的SP700型树脂的吸附容量较大，而且也容易解吸，理论上是一种性能特别好的大孔树脂，但它属于进口产品价格较贵。而AB-8大孔吸附树脂的分离效果也比较好，国内生产，AB-8大孔吸附树脂在实际生产种使用较多。基于此种情况，我们选择AB-8大孔树脂来分离皂角刺总黄酮。从七种大孔吸附树脂对皂角刺总黄酮的吸附容量、吸附率、解吸率、吸附动力学曲线等研究通过实验确定AB-8树脂纯化皂角刺总黄酮的条件为：供试液的上样浓度为0.2 mg/mL，用2 mL/min流速缓慢上样，以70%乙醇进行洗脱，洗脱流速为2 mL/min，树脂可重复利用三次。在此条件下，用AB-8大孔吸附树脂分离皂角刺中总黄酮，总黄酮的回收率可为82.8%。实验结果表明经过分离纯化浓缩干燥后，制得样品中总黄酮含量由4.37%提高至62.5%。该研究为皂角刺总黄酮的纯化提供实验方法,为进一步开发皂角刺有效部位新药提供参考。