定向进化转录调节基因提高漆酶异源表达

李 燕，杨建花，李宝库，朱蕾蕾*

(1.河北大学 药学院，河北 保定 071002；2.中国科学院天津工业生物技术研究所 工业酶国家工程实验室,天津 300308)

漆酶(Laccase, EC 1.10.3.2)是一种含有四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，能够催化多种酚类和非酚类的化合物[1-3]，因此在造纸漂白[4-5]、染料脱色[6-7]、食品加工[8]、环境保护[9]等领域有广阔的应用前景。但是，自然界的野生菌漆酶存在酶活低、产量低、培养周期长、高温易失活等问题，导致其难以应用于工业生产。随着分子生物学和基因组学的迅猛发展，通过定向进化技术来提高漆酶表达量、催化能力、稳定性及底物特异性等；寻找合适的载体进行漆酶基因的异源表达来提高表达量，都是目前解决问题的有效方法[10-12]。

定向进化是一种在实验室模拟达尔文进化的过程，通过对基因进行突变或重组，建立突变库以筛选到性能更好的蛋白，是一种最有前途的提高漆酶表达和性能的方法[13]。酿酒酵母因其操作简单，生产成本低，分泌表达易于纯化，能对表达蛋白进行加工、修饰等诸多优点脱颖而出，成为目前最主要的外源蛋白表达宿主之一[14]。此外，酿酒酵母因不产生毒素，安全性好，成为一种与人类生活密切相关的酵母, 广泛应用于食品工业和生物医药领域[15]。作为真核生物的模式菌, 酿酒酵母全序列的测定已于1996年完成，是目前了解最完全的真核生物[16]。因此，本章通过对漆酶Lcc转录调节区域进行突变，并将pYES2-Lcc突变质粒转化酿酒酵母进行异源表达，构建酿酒酵母菌株突变库，利用以ABTS为底物的酶活检测筛选方法，筛选出高酶活、高表达量的突变菌株。

1 材料与方法

1.1 菌株和质粒

大肠杆菌(Escherichiacoli) BL21Gold(DE3)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae) INVSc1菌株由本实验室保存，重组载体pYES2-Lcc由本实验室构建。

1.2 酶和试剂

Easy Taq®DNA Polymerase、10×Easy Taq®Buffer、2.5 mM dNTPs、基因Marker(Trans 15K DNA Marker)购自TransGen Biotech公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；酵母质粒小提试剂盒、无氨基酵母氮源(YNB)购自Solarbio公司。胰蛋白胨Tryptone、酵母提取物Yeast Extract购自英国OXOID 公司；琼脂糖Agar购自Sigma公司；2,2'-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)购自Coolaber公司；其它试剂均为国产分析纯。

1.3 培养基

(1) YPAD培养基：1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖，0.004%硫酸腺嘌呤，121℃灭菌15 min。

(2) SC-U培养基：0.67%无氨基酵母氮源，2%碳源(葡萄糖或棉子糖)，0.01% (腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸，色氨酸)，0.005% (天冬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸，缬氨酸)，固体培养基添加2% Agar，121℃灭菌20 min。

(3) HC预培养基：10% 10×YNB，10% 10×HC dropout solution，20% 200 g/L galactose，10% 1 mol/L pH值6.2 KH2PO4-KOH缓冲液，50%去离子水。

(4) HC表达培养基：10% 10×YNB，10% 10×HC dropout solution，20% 200 g/L galactose，10% 1 mol/L pH值6.2 KH2PO4-KOH缓冲液，0.2% 0.25 mol/L，59.8%去离子水，过滤除菌。

1.4 Lcc转录调节序列突变库构建

将实验室保藏的大肠杆菌BL21/pYES2-Lcc划线于LB (Amp)固体平板，挑取单克隆接种于LB (Amp)液体培养基，并于37℃、200 r/min的恒温摇床中过夜培养。利用质粒小提试剂盒提取pYES2-Lcc质粒，作为易错PCR的模板DNA，以fw-lcc-调节区域为上游引物，其碱基序列为5′-GTGGAAGCGGTATTCGCAATG-3′，rev-lcc-调节区域为下游引物，其碱基序列为5′-GAGCTCGGTACCAAGCTTAATATTCC-3′。反应体系：Template DNA (50 ng/μL) 2 μL，10 μM Forward Primer 2 μL，10 μM Reverse Primer 2 μL，10×EasyTaq®Buffer 10 μL，2.5 mM dNTPs 8 μL，EasyTaq®DNA Polymerase 2 μL，10 mM Mn2+，ddH2O 71 μL，total 100 μL。反应条件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，共30个循环；72℃ 10 min。每个小离心管装25 μL，放入PCR仪，反应结束后，取2 μL产物利用1%核酸胶电泳检测验证，通过胶回收纯化回收目的条带，命名为Lcc-ep.并将其重组到质粒上，取1 μL重组质粒电转入大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，电击后加入1 mL LB液体培养基混匀，37℃、200 r/min摇床中孵育1 h，分别涂布于含有Amp的LB固体平板(Amp抗性筛选)，37℃恒温培养箱倒置过夜培养。收集到的菌体用质粒小提试剂盒抽提质粒，按其说明书操作。

1.5 酿酒酵母的转化

用LiAc/SS载体DNA/PEG法高效转化冷冻活性酵母细胞，具体操作步骤如下：将配制好的ssDNA从-20℃冰箱取出，沸水中煮5 min，使其变性，取出后立即放入冰浴备用；将-80℃保藏的感受态细胞取出，放于37℃水中15～30 s，13000 r/min离心2 min，去除上清，依次加入下列：260 μL 50% (w/v) PEG 3350，36 μL1.0 mol/L LiAc，50 μL 2.0 mg/mL ssDNA，14 μL待转化的质粒(pYES2-Lcc-ep)及无菌水，360 μL总体积；用移液器充分混匀，放于42℃水浴20～60 min；13000 r/min离心30 s，去除上清；加入1 mL YPAD液体培养基重悬，放入30℃水浴2～3 h；取200 μL重悬液涂布于SC-U平板，30℃培养3～4天，即可长出转化子。

1.6 重组酿酒酵母的诱导表达及其筛选

表达：待SC-U平板长出转化子后，用无菌牙签随机挑取转化子接种到含150 μL的HC预培养基(含Amp，Kan)的96孔板(平底)中，封口，30℃，800 r/min摇床培养2天，并做空白、空质粒、野生型对照；用复制器复制到含180 μL的HC表达培养基(含Amp，Kan)的96孔板(尖底)中，20℃，800 r/min摇床培养3天；剩余菌液加入50 μL 50%甘油，-80℃冰箱保存。

96孔板筛选：从表达好的重组酿酒酵母96孔板中，取出20 μL菌液到新的96孔板，再加入180 μL去离子水，用酶标仪测波长600 nm下的吸光度；将96孔板剩余菌液4000 r/min，15 min离心，以ABTS为底物，以pH值3.0的柠檬酸为缓冲液，在420 nm下测定吸光度，按以下体系测酶活力：110 μL pH值3.0柠檬酸缓冲液，50 μL上清，40 μL ABTS (7 mM )。酶活力单位定义为：1 min内催化氧化1 μmol底物的酶量为1个酶活单位。筛选到的酶活高于野生型的突变菌株挑选出来，再从原母板用无菌牙签中蘸取菌液进行预培养基、表达培养，测OD600，测ABTS酶活力(步骤同上)；

摇瓶复筛：复筛到的高活性突变菌株从原母板取50 μL菌液接种到3 mL HC预培养基，30℃，200 r/min培养2天后转接到HC表达培养基(50 mL摇瓶/25mL培养基/250 μL菌液)，测OD600，收菌，测上清ABTS酶活力。

1.7 酿酒酵母高活性突变体序列测定

酿酒酵母高活性突变体抽提质粒，按酵母质粒提取试剂盒说明书操作；以提取的酿酒酵母高活性突变体质粒为模板做克隆PCR验证(T7 promoter、T7 terminator商业引物做正反向引物)；验证正确的突变体将提取的重组酿酒酵母质粒电转到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞；当平板上生长出单菌落时，挑取单克隆并接种至LB (Amp)液体培养基中，在37℃、200 r/min条件下培养12 h；将培养的菌液用质粒小提试剂盒提取大肠质粒，测DNA浓度并进行质粒验证，然后送至公司进行测序，将测序正确的菌株甘油冻存管储存在-80℃冰箱中。

1.8 漆酶高表达突变株调节区域序列比对

将测序结果进行整理，与原始序列进行同源比对，该过程用SnapGene软件完成，统计碱基突变位点。

2 结果与讨论

2.1 重组质粒的构建

以pYES2-Lcc质粒为模板，fw-lcc-调节区域、rev-lcc-调节区域分别为上下游引物进行易错PCR，克隆得到的产物，结果如图1所示，epPCR产物条带约1000 bp，克隆产物条带约为7602 bp，符合预期。该重组质粒及其调节区域如图2所示。

M代表Marker；1-2代表epPCR产物；3-4代表克隆产物

图2 重组质粒调节区域示意图Fig.2 Schematic diagram of the regulatory gene sequence of recombinant plasmid

2.2 重组酿酒酵母的筛选

对挑取的突变子利用ABTS检测方法进行初筛，以ABTS为底物测得酶活力高于野生型1.3倍的有46株。对46个优势菌株进行96孔板复筛，每个突变体设置4个平行样，获得13个优势突变体；最后对13个优势突变体进行摇瓶复筛，结果如图3所示。其中，酶活是野性型酶活1.5倍以上的突变株有3株，1.29～1.5倍的突变株有7株，1.04～1.2倍的突变株有3株。突变体M1酶活最高，可达35.4 U/L。

图3 野生型和13个优势突变体摇瓶复筛漆酶粗酶液酶活检测结果Fig.3 Activity detection results of crude enzymes from the flask cultivation of wild type and 13 dominant mutants

2.3 突变体序列测定及比对

为测定13个优势突变体中酶活最高的3株菌株的碱基序列，首先抽提酵母质粒，并对其进行克隆PCR，PCR产物验证电泳图如图4所示。从图中可以看到一条大小约为1500 bp的清晰条带，说明酵母质粒提取成功。之后将提取的重组酿酒酵母质粒电转到大肠杆菌BL21Gold(DE3)感受态细胞，接种单克隆培养，并抽提质粒，将质粒送公司测序，然后用SnapGene软件整理测序结果，与原序列比对后，发现活性最高的三个突变体在GAL1 promoter区域均有突变。因此推断，3个突变体上出现的4个突变加强了启动子与RNA聚合酶的结合，因此加速了漆酶基因的转录能力，从而引起漆酶表达量的提高。

M代表Marker，1-3代表M1、M2、M3突变体

3 结论与展望

本章通过对调节漆酶Lcc表达的调节区域进行突变，并将pYES2-Lcc突变质粒转化酿酒酵母进行异源表达，构建酿酒酵母菌株突变库，利用以ABTS为底物的高通量的筛选方法对突变库进行筛选，并对酶活高的突变体进行摇瓶复筛，最终获得了三株遗传稳定的高酶活突变体M1、M2、M3。它们的突变均在GAL1启动子区域，说明启动子上的突变引起了漆酶表达量的提高。通过定向进化转录调节区域，漆酶最高活性可达35.4 U/L。