串珠石斛组培快繁技术

俞涵曦, 王晶晶, 林 蔚, 丁金涛, 王雪妮, 李 菁, 何碧珠,2

(1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002;2.兰科植物保护与利用国家林业与草原局重点实验室，福建 福州 350002;3.福建农林大学海峡联合研究院基因组与生物技术研究中心，福建 福州 350002)

串珠石斛(DendrobiumfalconeriHook.)为兰科(Orchidaceae)石斛属(DendrobiumSw.)多年生草本植物，别名红鹏石斛、新竹石斛等，生于海拔800～1 900 m的岩石和树干上，主要分布于中国、不丹、印度等地。茎上多分枝，分枝节间肿大成珠状，叶窄长为狭披针形，花朵绮丽，花瓣为卵状菱形。串珠石斛具有养胃生津、滋阴除热的功效，是我国传统药用石斛。但串珠石斛自身繁殖能力差，且野生资源遭到过度开采，因此，有必要采取保护措施，并利用组织培养技术加快繁殖速度，满足市场需求。

目前，有关石斛组培的研究主要集中在铁皮石斛上[1-7]，串珠石斛组织培养仅杨玉珍等[8]研究了KC培养基和姚春等[9]比较了不同比例MS培养基对其生长的促进作用。本研究以串珠石斛蒴果内种子为外植体，比较了不同有机添加物和不同比例激素对其生长的影响，以期为加快种苗繁育、缩短生产周期与实现规模生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

串珠石斛蒴果采自云南怒江，为开花授粉后120～ 160 d、成熟度达80%且未开裂的蒴果(图1)。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体的消毒 串珠石斛蒴果用清水冲洗干净后，再用软毛刷蘸取洗涤剂清洗果实缝隙，之后用洗涤剂浸泡15 min，流水冲洗材料30 min，置超净工作台用体积分数为75%乙醇消毒30 s，用无菌水冲洗1次，再用质量分数为5%的次氯酸钠消毒8 min，无菌水冲洗3～4次，最后用滤纸擦干表面水分备用。

1.2.2 种子萌发 用手术刀纵向切开果荚，将附着于蒴果内的种子均匀接在诱导培养基上。由于6-BA和NAA是石斛兰种子萌发较为重要的生长调节剂[10]，因此，诱导培养基以1/2MS+1.0 g·L-1活性炭+1.0 g·L-1蛋白胨作为基础培养基，并分别加入不同质量浓度的6-BA(1.0、1.5、3.0 mg·L-1)、NAA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1) 进行正交试验，以分析不同激素组合对串珠石斛种子萌发的影响。每个处理20瓶，重复3次。先暗培养2周以促进种子萌发；培养50 d时，每瓶取3个1 cm×1 cm样方在解剖镜下统计萌发率，3次重复。

萌发率/%=(绿色膨大原球茎数/接种种子数)×100

1.2.3 原球茎增殖分化 将诱导培养获得的原球茎切下，接种在继代培养基上。有机添加剂可降低新生组织褐化程度并促进增殖[11]。为此，继代培养基以MS+1.0 g·L-1活性炭+2.0 mg·L-16-BA为基础培养基，分别加入不同有机添加物(1.5 g·L-1花宝1号、1.0 g·L-1蛋白胨、40 g·L-1香蕉、40 g·L-1马铃薯)，观察有机添加物对其原球茎增殖分化的影响。4个处理各20瓶，每瓶接种5个原球茎，培养30～40 d，3次重复。

原球茎增殖系数=培养后获得的有效增殖原球茎数/接种原球茎数

1.2.4 壮苗生根 选取继代增殖培养获得的1～3 cm的苗，切去叶片，转接到生根培养基中。香蕉和NAA均可促进石斛壮苗生根[12]。因此，以MS+1.0 g·L-1活性炭作为基础培养基，分别添加不同质量浓度的香蕉(40、45、50 g·L-1)、NAA(0.5、1.0、1.5 mg·L-1)。6种培养基分别接种20瓶，每瓶接5丛，每2株一丛，重复3次。培养90 d，每种处理随机选取10瓶，每瓶取6株统计生根率。

生根率/%=(生根苗数/接种组培苗数)×100

1.2.5 训化移栽 当壮苗生根获得的试管苗长至3 cm以上且有3～4片叶时，即可移栽。移栽前，将培养瓶置于温室自然光下炼苗5～7 d。然后取出试管苗，用清水洗净残留培养基，置于通风阴凉处晾苗1 h。把炼苗后的试管苗移栽到进口水草基质中，第1次浇透水，之后基质保持一定湿度即可。串珠石斛喜湿、耐寒，移栽环境需阴凉，避免阳光直射，空气相对湿度不低于80%。

1.2.6 试验条件 光照强度为1 500～2 000 lx，培养室温度均控制在(25±2) ℃，每天光照12～16 h。诱导培养基、继代培养基、生根培养基pH值均为5.6～5.7。培养基装瓶后，放入高压锅内(121 ℃，0.14 MPa)高压灭菌30 min。

2 结果与分析

2.1 激素组合对串珠石斛种子原球茎诱导的影响

从表1可见，9个处理种子均可萌发，但不同质量浓度6-BA和NAA组合对萌发率的影响不同。当NAA质量浓度相同时，3种质量浓度6-BA均以1.5 mg·L-1处理的萌发率最高，显著高于其他浓度6-BA处理。当6-BA为3.0 mg·L-1时，出现抑制，萌发率不增反减，原球茎颜色淡或成半透明状，长势不佳。当6-BA质量浓度相同时， 3种质量浓度NAA对萌发率的影响均不显著，但NAA为0.5 mg·L-1时，平均萌发率高于其他浓度NAA的处理。综合来看，激素组合为1.5 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1NAA时，种子萌发效果最好，原球茎饱满翠绿，萌发率达95.88%(图2)。

表1 激素组合对串珠石斛种子原球茎诱导的影响1)Table 1 Effect of hormone combination on protocorm induction of D.falconeri seeds

1)同列数值后附不同小写字母者表示差异达0.05显著水平。

2.2 有机添加物对串珠石斛原球茎增殖分化的影响

4种有机添加物对串珠石斛增殖分化的影响见表2。其中，添加1.5 g·L-1花宝一号处理增殖系数仅20.3，与其他处理差异显著，原球茎较小且偏黄，增殖速度较慢，并部分出现褐化现象；添加1.0 g·L-1蛋白胨处理长势一般，原球茎颜色浅；添加40 g·L-1马铃薯和40 g·L-1香蕉的2种处理，增殖系数明显高于其他处理，且两者间差异不显著。总体来看，添加40 g·L-1马铃薯处理增殖系数最高(46.3)，原球茎绿色饱满、长势好，部分原球茎分化出小苗，顶部长出2～3片叶(图3)。因此，添加40 g·L-1马铃薯更有利于串珠石斛增殖分化。

表2 有机添加物对串珠石斛原球茎增殖分化的影响1)Table 2 Effect of organic additives on proliferation and differentiation of D.falconeri protocorm

1)同列数值后附不同小写字母者表示差异达0.05显著水平。

2.3 添加物对串珠石斛壮苗生根的影响

壮苗生根培养第1周时，各处理变化不明显。90 d后，各处理中苗的长势逐渐有区别。由表3可见，添加香蕉的处理生根率均高于添加NAA的处理。在6个处理中，以添加45 g·L-1香蕉的生根率最高(93.2%)，生根速度快，平均每株生根数达6.2 条，根粗壮根毛多，与其他处理差异显著；添加40、50 g·L-1香蕉的生根率分别为91.3%、90.8%；添加0.5 mg·L-1NAA生根率仅70.6%，生根速度最慢，平均每株生根数仅2.3条，显著低于其他处理。因此，最适合串珠石斛壮苗生根的培养基为：MS+1.0 g·L-1活性炭+45 g·L-1香蕉。

表3 不同添加物对串珠石斛壮苗生根的影响1)Table 3 Effects of different additives on rooting of D.falconeri

1)同列数值后附不同小写字母者表示差异达0.05显著水平。

2.4 串珠石斛训化移栽

炼苗7 d后，叶色变为浓绿，茎秆与根系逐渐粗壮，组培苗根茎叶功能恢复，自养能力提高。移栽时以进口水草为培养基不仅保湿透气且杂质少、净含量高，移栽后，苗长势好、叶色深，成活率达到90%以上(图4)。

3 讨论与小结

据Kitsaki et al[13]和Udomdee et al[14]研究表明，种子到达一定成熟度后其萌发率不再随成熟度的增加而提高。由于过于成熟的种子自然开裂，蒴果内种子与外界环境接触提高了污染率，同时在为蒴果消毒时，种子直接与5%次氯酸钠接触可能导致种子死亡，使成活率大大降低，但未成熟的种子发育未完全，萌发率低，也不适用于接种培养。因此，本研究采用成熟度为80%的未开裂蒴果进行组织培养，萌发率高达95.88%。

据章鹏程等[15]研究发现，不同的6-BA与NAA浓度对大花蕙兰种子萌发形成原球茎具有显著影响。张华通等[5]研究表明，6-BA与NAA对石斛种子的诱导效果不同，6-BA更有利于原球茎的增殖，而NAA对芽苗的生长更有益。张雪梅等[6]研究认为，6-BA>1.0 mg·L-1时，会抑制原球茎生长；而杨立昌等[4]研究认为，3.0 mg·L-16-BA的诱导效果最好。本研究表明，当6-BA为1.5 mg·L-1时，种子萌发快，萌发率均大于90%；而6-BA为3.0 mg·L-1时，则抑制种子萌发。试验结果差异可能与外植体材料不同有关。黄靖等[3]研究表明，NAA为0.5 mg·L-1时最有利于诱导原球茎，这与本试验结果基本相同。

张治国等[7]研究发现，20%马铃薯、20%香蕉和20%荸荠等3种有机添加物中，20%马铃薯对促进铁皮石斛的原球茎分化效果最好。此外，仇硕等[16]对报春石斛原球茎增殖分化的研究也得到了类似结果。本研究表明，有机添加物对串珠石斛原球茎增殖分化的促进效果表现为：40 g·L-1马铃薯>40 g·L-1香蕉>1.0 g·L-1蛋白胨>1.5 g·L-1花宝一号。

杨宏艳等[17]研究认为，NAA有利于根系的分支和根冠比的提高，可促进植物生根培养。邓瑞云等[1]研究发现，香蕉汁更有利于石斛的根系生长，低浓度NAA对石斛根系发育并无作用。陈尔等[2]研究也表明，对铁皮石斛生根的促进效果依次为：香蕉汁>活性炭>NAA。本研究发现，添加香蕉处理比添加NAA处理生根率高、根系生长粗壮，香蕉质量浓度在45 g·L-1时生根率最高(93.2%)。