芳伯胺染料对蚕丝素显色性修饰的吸附特性研究

高普 崔志华 陈维国

摘要： 为探明在Mannich反应修饰蚕丝素中芳伯胺染料修饰剂分子在蚕丝素上的吸附规律，通过分别测定pH值对蚕丝素带电情况、染料的溶解、蚕丝素得色量三方面因素的影响，结合吸附动力学机理研究，得到如下结论：由于芳伯胺染料和蚕丝素均具有正负两性性质，芳伯胺染料在蚕丝素上的吸附受pH值的影响十分显著;当pH值偏酸性时有利于染料对蚕丝素的吸附，当pH值为4.0时吸附量最大、着色最深;而吸附动力学机理研究表明，Mannich反应修饰方法能显著促进芳伯胺化合物在蚕丝素上的吸附量，其吸附机理较符合准二级动力学吸附模型，且在30～60 ℃内升高温度会降低对准二级动力学模型的符合程度。

关键词： 芳伯胺染料;蚕丝素;显色;修饰;吸附特性

中图分类号： TS190.2   文献标志码： A   文章编号： 1001

Abstract： In order to explore the adsorption rule of aromatic primary amine modified molecules on silk protein in Mannich reaction， this study determined the influence of pH value on three factors， namely， the electrification state of silk， the dissolution of dye and the chroma yield of silk， and combined with the adsorption kinetic mechanism， the following conclusions were obtained： the adsorption behavior of aromatic amine dyes on silk is significantly affected by the pH value of aromatic amine dyes on silk protein. When the pH value is acidic， it is beneficial to the adsorption of silk fibroin， and when the pH value is 4.0， the adsorption capacity is the largest. The adsorption kinetic mechanism study shows that the Mannich reaction modification method can significantly promote the adsorption capacity of aromatic amine compounds on silk， and its adsorption mechanism is more in line with the quasi-second-order kinetic adsorption model. Besides， the temperature rise within 30～60 ℃ will reduce the degree of conformity to the quasi-second-order kinetic.

Key words： aromatic amine dyes; silk fibroin; coloration; modification; adsorption characteristics

蚕丝素富含优质蛋白，素有“纤维皇后”的美誉。近些年，蚕丝素在生物医药材料如再生骨骼材料、人工血管、人工皮肤、神经元修复材料、药物载体等方面的应用，成为科学界关注的热点[1-3]。为进一步提升蚕丝素材料的耐光、机械性能及与功能材料相容性等，众多学者采用化学修饰方法进行了相关研究[4-6]，有效地促进了蚕丝素在生物医药等领域的应用。

基于Mannich反应的芳伯胺化合物对蛋白质的修饰方法是一种有效的化学修饰方法[7]。将该方法应用于对蚕丝素中的特定氨基酸进行可控化定位修饰，具有反应条件温和、对蛋白损伤小、修饰效果显著的特點。应用该方法能够将含有芳伯胺基团的特定修饰剂引入蚕丝素中（图1），不仅有助于改善蚕丝素的化学及机械性能，且能赋予蚕丝素特殊功能，对于提升蚕丝素在生物材料方面的应用有重要价值[8-9]。

前期研究中设计了一系列有色芳伯胺化合物即芳伯胺染料，基于Mannich反应方法对蚕丝素进行修饰，对该方法在蚕丝素上的应用规律等进行了一定的研究，实现了利用芳伯胺化合物显色来定量表征化学修饰的显色性修饰方法[10]。为进一步探索芳伯胺化合物在蚕丝素上的吸附规律，本文从修饰浴pH值、电荷变化等，对吸附性能及其吸附动力学的影响等多方面进行了研究。对于探明芳伯胺染料Mannich反应法修饰蚕丝素的应用规律，进而推动该方法在蛋白修饰中的应用具有重要意义。

1 实 验

1.1 材料及仪器

为提高测试的便利性，本文选用蚕丝素织物作为研究对象。同时为赋予修饰效果以良好的可视性，本文选用芳伯胺染料作为修饰功能分子进行研究。织物规格：11205电力纺练白胚，平方米质量为40 g/m2（杭州喜得宝丝绸有限公司），实验中采用的芳伯胺修饰剂酸性棕4（C.I.14805）为工业品，分子式如图2所示（杭州下沙恒升化工有限公司），甲醛为分析纯（杭州高晶精细化工有限公司），酸度仪（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），TU-1905紫外-可见光分光广度计（上海朗赋实业有限公司），ZetaPALS固体电位仪（布鲁克海文仪器公司），SHIMADZUUV-2550紫外可见光光度计（日本岛津公司）。

1.2 方 法

1.2.1 Zeta電位测定

使用ZetaPALS固体电位仪，测定蚕丝素在不同pH值溶液中的Zeta电位，测试压力为3×104 Pa，Gap height调节至100 μm。由于本文仪器是基于流动电位法测定固体表面膜的Zeta电位，不适于测定液体的Zeta电位，因此未对染料溶液的Zeta电位进行测试。

1.2.2 Mannich反应法蚕丝素修饰实验

酸性棕4质量浓度为400 mg/L，甲醛与酸性棕4摩尔比为1 ︰ 30，调节pH值，30 ℃震荡处理10 h。对照空白实验中不用甲醛，其他条件同上。

1.2.3 蚕丝素Mannich反应法修饰效果测定

利用Datacolor测试仪测试处理完毕并烘干试样的布面K/S值。测试条件为D65光源、10°视场，每个试样重复测试4次，取平均值。

1.2.4 溶液吸光度的测定

配制质量浓度为5 g/L的酸性棕4染料溶液，冰醋酸调pH值，静置48 h后离心，留上层清液，用紫外-可见光分光光度计测吸光度。

1.2.5 标准工作曲线绘制

基于郎伯比尔定律的残液法测定芳伯胺染料在蚕丝素上的吸附规律，具体实验方法：用100 mL容量瓶配制1 g/L的芳伯胺染料，分别稀释至一定倍数，测吸光度，绘制标准工作曲线（图3）。

1.2.6 吸附动力学实验

对酸性棕4进行提纯，配置含染料质量浓度2 mg/L、甲醛质量浓度6 mg/L的混合溶液，冰醋酸调pH值到4.0;称取11块质量为0.5 g的蚕丝素织物，待溶液升温至特定温度，投入蚕丝素织物，特定温度下恒温处理一定时间，取出布样;并用DMF在70 ℃剥色10 min，剥色液连同残液一起转移至容量瓶并定容，测吸光度。常规染色法的工艺同上，但是溶液中不加入甲醛，温度为90 ℃。

2 结果与分析

2.1 芳伯胺修饰剂在蚕丝素上的吸附行为

从图4可以看出，由于芳伯胺修饰剂酸性棕4带有磺酸基和氨基，因此具有两性特征;蚕丝素是由众多氨基酸组成，也含有氨基和羧基，同样具有两性特征。当酸性棕4和蚕丝素所处环境的pH值发生变化时，各自所带电荷量甚至带电荷性会发生变化，这将直接影响酸性棕4在蚕丝素上的吸附总量和最终的修饰效果。因此，研究pH值对蚕丝素带电荷性、酸性棕4的吸附特性的影响，对于探明芳伯胺染料对蚕丝素的修饰效果显得至关重要。

图5为蚕丝素在不同pH值时表面的Zeta电位变化规律。从图5可以看出，pH值对于蚕丝素表面的带电情况影响很大。当pH值大于4.0时蚕丝素表面带负电，当pH值小于4.0时蚕丝素表面带正电荷，所采用的蚕丝素等电点为4.0左右。图6为pH值对酸性棕4溶液吸光度的影响，吸光度较大说明溶液中的单分子状态的染料分子数量较多，即染料的溶解更好，更有利于染料在蛋白上的吸附和发生修饰反应。

对于芳伯胺染料，当其处于等电点时，由于分子所带的正负电荷相同，其溶解度最低。基于此理论，本文通过吸光度随pH值变化规律来近似模拟芳伯胺染料Mannich法修饰蚕丝素的实际反应过程中染料溶液的变化情况，对于其在修饰反应中的吸附行为提供一定参考。从图6可以看出，酸性棕4的溶解性受pH值的影响十分显著，当pH值为2.0左右时溶解性最差，说明染料的等电点在pH2.0左右。当溶液pH值大于2.0时，染料带负电荷，溶液的吸光度随pH值的增大而逐渐增大;当pH值在1.0～2.0时，染料带正电荷，溶液吸光度随pH值的降低而逐渐增大。所以，当pH值小于4.0时蚕丝素表面带正电荷，当溶液pH值大于2.0时，染料带负电荷，染料溶解性增大。所以，pH值在2.0～4.0时，最有利于带负电荷的染料在带正电荷的蚕丝素上发生吸附。

图7为pH值对酸性棕4对蚕丝素显色修饰效果的影响，用显色修饰后的蚕丝素织物表面的色深值来表示修饰效果。从图7可以看出，pH值对显色修饰效果的影响十分显著。但是，与空白吸附试样相比，Mannich反应法修饰的试样受pH值的影响更加明显，且在不同pH值条件下的修饰试样K/S值均较高。对于Mannich反应法修饰的试样，酸性条件修饰可得到更高的K/S值。且当pH值在蚕丝素等电点（pH值为4.0）以上时，试样的K/S值随pH值增大而呈现下降趋势;当pH值在蚕丝素等电点以下时，试样的K/S值随pH值降低而呈现下降趋势，在pH4.0等电点时修饰效果最佳。分析认为：当pH值为4.0时，蚕丝素处于等电点附近，蚕丝素表面呈电中性至正电性，而酸性棕4位于其自身等电点以上，带有负电荷，染料和蚕丝素之间具有极强的吸附作用。因此，当溶液pH值在等电点附近时能够得到最佳的修饰效果。

2.2 芳伯胺染料对蚕丝素显色修饰的吸附动力学机理

为了进一步揭示芳伯胺修饰剂在蚕丝素上的吸附规律，从吸附动力学角度对其修饰行为进行了探讨。

图8是在pH4.0时，不同温度下C.I.酸性棕4修饰蚕丝素的时间t和吸附到蚕丝素上的染料质量qt的关系曲线，其中90 ℃为常规酸性染料染色对比样，即不加醛、按照一般酸性染料染色方法时的吸附曲线。结合图7可以看出，应用Mannich法修饰蚕丝素蛋白过程中，酸性棕4分子在蚕丝素上的平衡吸附量远远高于常规酸性染料染色法。说明在Mannich法中修饰中，甲醛的参与显著促进了修饰剂分子在蚕丝素上的吸附。应用Mannich法修饰时，平衡吸附量随着温度升高而出现明显下降，说明该方法适合在较低的温度下进行，温度升高，不利于芳伯胺化合物对蚕丝素的吸附，进而影响其化学修饰，也证实了Mannich法修饰是一种反应条件温和的修饰反应。

2.3 芳伯胺修饰蚕丝素的吸附动力学模型

为探讨Mannich反应修饰中芳伯胺修饰剂在蚕丝素上的吸附机制，分别采用准一級动力学和准二级动力学模型对吸附规律进行了研究。

在同样温度下准二级动力学模型的拟合度在0.95～0.98，拟合度较高。且理论计算出的最大吸附量qe与实验所得数据相差较小，说明准二级动力学模型能较好地描述芳伯胺染料Mannich法修饰蚕丝素中的吸附机理。并且对比后发现，实验温度越低实验结果对模型的符合程度越高。说明Mannich修饰反应较适宜在较低的温度进行，温度升高会使得副反应概率增大，对修饰反应造成一定的负面影响而降低修饰效果。

3 结 论

通过分别测定pH值对蚕丝素带电情况、染料的溶解、蚕丝素得色量三方面因素的影响，结合吸附动力学机理分析，研究了芳伯胺染料在蚕丝素蛋白上的吸附行为，得到如下结论。

1）由于芳伯胺染料和蚕丝素在水中均具有正负两性性质，芳伯胺染料在蚕丝素上吸附时受pH值的影响十分显著。pH值在2.0～4.0时，最有利于染料在蚕丝素上的吸附。当pH值为4.0时吸附量最大。

2）应用芳伯胺化合物酸性棕4染料对蚕丝素进行Mannich反应法修饰，借助芳伯胺染料的显色性能表达出显著的修饰效果。当pH值为4.0时，芳伯胺染料在蚕丝素织物上显示的颜色最深。

3）芳伯胺化合物Mannich法修饰蚕丝素更加符合准二级动力学模型，在30～60 ℃内升高温度会降低对准二级动力学模型的符合程度。

PDF下载参考文献：

[1]SMEETS R， KNABE C， KOLK A， et al. Novel silk protein barrier membranes for guided bone regeneration[J]. Journal of Biomedical Materials Research Part B： Applied Biomaterials， 2017， 105（8）： 2603.

[2]BUCCIARELLI A， MULLONI V， MANIGLIO D， et al. A comparative study of the refractive index of silk protein thin films towards biomaterial based optical devices[J]. Optical Materials， 2018， 78： 407-414.

[3]NGUYEN H T， LUONG H T， NGUYEN H D， et al. Investigate the effect of thawing process on the self-assembly of silk protein for tissue   applications[J]. Biomed Research International， 2017， 2017（2）： 1-16.

[4]VILA N T， FERREIRA A， SILVA M G D， et al. Surface modification of silk by（DBD） dielectric barrier discharge treatment for dyeing with natural dye yerba mate[J]. Procedia Engineering， 2017， 200： 170-177.

[5]CAO J， WANG C. Multifunctional surface modification of silk fabric via graphene oxide repeatedly coating and chemical reduction method[J]. Applied Surface Science， 2017， 405： 380-388.

[6]LIU L， ZHANG S， HUANG J Y. Progress in modification of silk fibroin fiber[J]. Science China Technological Sciences， 2019，62： 919-930.

[7]JOSHI N S， WHITAKER L R， FRANCIS M B. A Three-component mannich-type reaction for selective tyrosine bioconjugation[J]. Journal of the American Chemical Society， 2004， 126（49）： 15942-15943.

[8]郑旭. 基于Mannich反应的蚕丝蛋白质修饰及其光稳定性[D]. 杭州： 浙江理工大学， 2015.

ZHENG Xu. The Modification of Silk Protein With Mannich Reaction and Its Photo Stability[D]. Hangzhou： Zhejiang Sci-Tech University， 2015.

[9]ZHENG J P， CHEN W G， CUI Z H， et al. Research on the structure and properties of silk modified witharomatic primary amine dye/formaldehyde[J]. Journal of Silk， 2018， 55（3）： 7-14.

[10]CHEN W G， GAO P， JIANG H， et al. A novel reactive dyeing method for silk fibroin with aromatic primary amine-containing dyes based on the Mannich reaction[J]. Dyes and Pigments， 2019， 168： 300-310.

[11]张庆芳， 金鑫， 王磊， 等. 花生壳吸附Cr（Ⅵ）动力学方程研究[J]. 安全与环境学报， 2011， 11（2）： 83-86.

ZHANG Qingfang， JIN Xin， WANG Lei， et al. On the kinetic equation of peanut shell adsorption Chromium（Ⅵ）[J]. Journal of Safety and Environment， 2011， 11（2）： 83-86.

[12]師维.基于离子液体及聚离子液体的磷脂酰丝氨酸分离方法研究[D]. 杭州： 浙江大学， 2017.

SHI Wei. Ionic Liquid and Polys（Ionic Liquid） Based Separation Methodsfor Study on of Phosphatidylserinepurification[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2017.

[13]支娟娟. β-环糊精微球的制备、载药、吸附及解吸附的研究[D]. 西安： 陕西科技大学， 2012.

ZHI Juanjuan. Researchon the Preparation， Drug Delivery Systems， Adsorption and Desorption of β-cyclodevrin Polymer Microspheres[D]. Xian： Shaanxi University of Science and Technology， 2012.

[14]杨丽霞， 岳田利， 袁亚宏， 等. 失活酵母菌吸附猕猴桃汁中氯吡脲的动力学及热力学研究[J]. 现代食品科技， 2016（4）： 128-135.

YANG Lixia， YUE Tianli， YUAN Yahong， et al. Kinetics and thermodynamics of forchlorfenuron biosorption from kiwifruit juice by inactivated yeast biomass[J]. Modern Food Science and Technology， 2016（4） ： 128-135.