饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪肝脏氧化还原状态和线粒体功能的影响

张 浩，陈代文，余 冰，何 军，虞 洁，毛湘冰，罗玉衡，黄志清，罗钧秋，郑 萍

（四川农业大学动物营养研究所/动物抗病营养教育部重点实验室，四川雅安 625014）

现代种猪选育技术提高了母猪窝产仔数，但是也造成低出生重（low birth weigh，LBW）仔猪发生率明显上升，自然发生的LBW仔猪比例高达15%～20%[1-2]。LBW仔猪是指出生重低于1.0 kg的仔猪[3]，其产生的主要原因是宫内发育迟缓，即哺乳动物妊娠期胚胎或胎儿发育受阻[2，4]。前人研究发现，LBW提高了仔猪断奶前死亡率，而且即使成活的LBW仔猪其生长性能也显著低于正常出生重（normal birth weight，NBW）仔猪[5-7]。

有关报道表明，出生和断奶时LBW新生儿的抗氧化能力显著下降[3，8-9]。本实验室前期研究发现，与NBW仔猪比较，LBW仔猪抗氧化系统遭到显著破坏，氧化损伤明显增强，表明LBW仔猪遭受到了氧化应激[3]。活性氧（reactive oxygen species，ROS）是细胞代谢不可避免的产物[10]，如果细胞内ROS无法被及时有效清除，其能作用于线粒体，将会对细胞线粒体功能造成严重损伤，造成细胞内的氧化损伤[11]。当线粒体遭受损伤时，电子传递链、氧化磷酸化、细胞内氧化还原系统以及线粒体蛋白的表达等都发生异常变化，不能合成足够的ATP，造成细胞生长代谢紊乱，从而导致细胞功能异常，严重时造成细胞死亡[12]。

白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种非黄酮类的多酚化合物，广泛存在于葡萄、松树、虎杖、决明子和花生等天然植物或果实当中[13]。肠道、肝脏和肺脏都是RES在动物体内代谢的主要器官[14]。RES是一种Nrf2的激活剂，可以通过激活Nrf2/HO-1通路，上调下游抗氧化基因表达、提高抗氧化酶活性和机体抗氧化能力，缓解机体氧化损伤[15-21]。但是，饲粮添加RES对LBW哺乳仔猪氧化损伤主要位点线粒体功能的研究较少；因此，本研究通过揭示饲粮添加RES改善LBW哺乳仔猪肝脏氧化还原状态和线粒体功能的作用机制，为生产中利用RES改善LBW哺乳仔猪健康发育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与试验设计

试验选取胎次接近、产期一致的初产母猪所产仔猪，参考Zheng P.等[3]的选择标准，首先标记出40头（0.8～1.0）kg的新生 LBW 仔猪和 20 头（1.5～1.7）kg的新生NBW仔猪，前三天充分采食初乳，4日龄时，将原来的20头LBW（BW：1.16 kg+0.07 kg）仔猪分为LBWC组和LBW+RES组，并从原来的20头NBW仔猪选取10头NBW（BW：2.07 kg+0.10 kg）仔猪，每组按体重相近、公母比例一致的原则分组，每个处理10个重复，每个重复1头猪。LBWC组和NBWC组饲喂基础饲粮，LBW+RES组饲喂基础饲粮添加600 mg/kg RES基础饲粮为人工乳。饲养21天。

1.2 试验材料

RES由陕西慈缘生物有限公司提供，纯度为98%。

1.3 试验饲粮

试验饲粮为人工配方乳，基础饲粮组成见表1。LBW+RES组饲粮在基础饲粮中添加600 mg/kg RES。饲喂前按照代乳粉∶水=1∶4的比例加入40℃温开水中充分溶解，奶瓶饲喂，吃饱为准。

1.4 饲养管理

试验在四川农业大学动物营养研究所教学科研基地进行，所有仔猪单笼饲养于仔猪代谢笼中。试验前对圈舍及代谢笼进行全面消毒，试验期间圈舍温度控制在28～30℃。每天饲喂7次，时间分别为 06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00 和 24:00，每次饲喂以仔猪吃饱为准。试验期间不对猪只使用任何抗生素类药物，其余按基地要求进行操作管理。

1.5 样品采集与处理

1.5.1 血液样品采集

试验第22天清晨，对所有试验猪进行空腹采血，将采集的前腔静脉血缓缓注射入采血管中，3 500 r/min离心15 min，分离血清，分装，-20℃保存待测。

表1 基础饲粮组成及营养水平（风干基础）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets（air-dry basis） %

1.5.2 肝脏组织样品采集

屠宰后，分离仔猪肝脏组织，用滤纸吸干表面，于冰上剪取肝脏组织，置于无菌冻存管中，锡箔纸包好，液氮速冻，-80℃保存待测。

1.6 测定指标与方法

1.6.1 血清氧化还原指标

血清CAT、SOD、GPx酶活和MDA含量均采用试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）进行检测，操作均按照试剂盒说明书严格进行。

1.6.2 肝脏氧化还原指标

测定之前将肝脏组织样品进行匀浆，制成10%匀浆液待测。肝脏CAT、SOD和GPx酶活以及MDA和TP含量均采用试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）进行检测，操作均按照试剂盒说明书严格进行。

1.6.3 肝脏游离Ca2+浓度、ATP和线粒体mPTP含量

肝脏组织Ca2+浓度、ATP和TP含量均采用试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国）进行检测，操作均按照试剂盒说明书严格进行。

肝脏线粒体mPTP采用Elisa试剂盒（江苏酶免实业有限公司，中国）测定，操作均按照试剂盒说明书严格进行。

1.6.4 肝脏基因表达测定

采用实时定量PCR法测定肝脏氧化还原和线粒体功能相关基因mRNA表达量。总RNA提取按照试剂盒（Trizol Reagent，TakaPa，日本）说明进行，RNA质量检测使用核酸蛋白检测仪（Beckman DU-800，CA，美国）检测260 nm和280 nm处吸光度，A260/A280比值表示RNA的纯度，该比值位于1.8～2.0之间表明RNA纯度较好。cDNA合成按照逆转录试剂盒（PrimeScriptTMregent kit，TaKaRa，日本），具体操作步骤参照说明书进行，反应结束后-20℃保存。引物均由上海生工生物工程公司合成，引物序列见表2。样品的实时荧光定量PCR扩增，反应体系为 10 μL：5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（2×），0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，3 μL 双蒸水，1 μL cDNA模板。采用两步法PCR扩增标准程序：模板预变性，95 ℃，30 s；扩增，95 ℃，5 s，适宜的退火温度，30 s，共 42 个循环；溶解曲线，55～95 ℃，温度以0.5℃/s速率提升。组织中各基因的相对表达量以 β-actin 作为内参基因，采用 2-△△Ct法计算[22]。

表2 实时定量PCR引物序列及参数Table 2 Sequences and parameters of primers for the real-time qPCR

1.7 数据统计分析

试验数据首先采用Microsoft Excel 2016进行整理，再采用SPSS 22.0软件中的GLM模型进行单因素方差分析，结合Duncan氏多重比较，分析各处理间的差异显著性，所有试验数据均以平均值标准误表示，P＜0.05视为差异显著，0.05≤P＜0.10视为有变化趋势。

2 结果

2.1 饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪血清抗氧化酶活性与MDA含量的影响

如表3所示，饲粮补充RES显著提高LBW仔猪血清 CAT 活性（P＜0.05），而对血清 SOD、GPx活性和MDA含量均无显著影响（P＞0.05）。

表3 饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪血清抗氧化酶活性与MDA含量的影响Table 3 Effects of dietary RES supplementation on serum antioxidant enzyme activities and MDA content of LBW suckling piglets

2.2 饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪肝脏抗氧化酶活性与MDA含量的影响

如表4所示，与NBWC仔猪比较，LBWC仔猪肝脏CAT活性显著降低（P＜0.05）；饲粮补充RES显著提高LBW仔猪肝脏CAT活性（P＜0.05）。

2.3 饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪肝脏Ca2+、mPTP和ATP含量的影响

如表5所示，与NBWC仔猪比较，LBWC仔猪肝脏ATP含量显著降低（P＜0.05）；饲粮补充RES显著提高LBW仔猪肝脏ATP含量（P＜0.05）。

2.4 饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪肝脏线粒体功能相关基因表达的影响

如表6所示，与NBWC仔猪比较，LBWC仔猪肝脏COX I mRNA表达量显著降低（P＜0.05）；饲粮添加白藜芦醇显著提高LBW仔猪肝脏NRF1 mRNA 表达量（P＜0.05）。

表4 饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪肝脏抗氧化酶活性与MDA含量的影响Table 4 Effects of dietary RES supplementation on hepatic antioxidant enzyme activities and MDA content of LBW suckling piglets

表5 饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪肝脏Ca2+、mPTP和ATP含量的影响Table 5 Effects of dietary RES supplementation on free Ca2+，mPTP and ATP contents in LBW suckling piglets

表6 饲粮添加白藜芦醇对低出生重哺乳仔猪肝脏线粒体生物合成与功能相关基因表达的影响Table 6 Effects of dietary RES supplementation on mitochondrial biogenesis and function indexes in liver of LBW suckling piglets

3 讨论

前人研究报道表明，LBW显著影响仔猪生长发育[2，23-25]，且有大量研究显示LBW可能更容易造成动物氧化还原平衡破坏[4，23]。前人研究证明，LBW仔猪更容易遭受氧化损伤[29-32]。王远孝等[31]研究哺乳仔猪肠道氧化还原状态发现，与NBW仔猪比较，LBW仔猪空肠T-AOC、GSH含量和SOD、GPx、CAT活性显著降低。本试验结果表明，LBW降低肝脏CAT活性，说明LBW仔猪肝脏抗氧化系统受损，这与前人研究结果一致[5，29，33]。RES 是高效的抗氧化剂，抗氧化能力强[34-36]。近年研究显示，RES可以显著抑制动物机体内ROS产生，减轻氧化损伤，修复线粒体内结构功能损伤，增强仔猪抗氧化能力[17-18，26]。R.Turkmen等[17]在添加375 mg/kg亚慢性口服草甘膦类除草剂的大鼠饲粮中，补充20 mg/kg RES显著缓解大鼠脂质过氧化、改善抗氧化系统。本试验结果表明饲粮添加RES能显著提高LBW仔猪血清和肝脏CAT活性，表明饲粮补充RES对LBW仔猪抗氧化功能有提高作用。

线粒体呼吸链的功能是进行生物氧化，并与ATPS相偶联，共同完成氧化磷酸化过程，并生产能量分子ATP[37]。Cyt C、COX I和COX IV都是呼吸链中重要的酶，其表达量降低说明线粒体的电子传递功能受损[5]。Liu J.等[23]在仔猪上研究显示，LBW显著降低仔猪肝脏CytC和COX IV mRNA表达量。本试验中，与NBW比较，LBW显著降低肝脏COX I mRNA表达量，表明LBW仔猪呼吸链关键蛋白基因表达下调，导致线粒体呼吸链电子传递功能受损。A.Csiszar等[38]研究发现，RES在人冠状动脉内皮细胞中诱导线粒体生物发生，增加线粒体质量和mtDNA含量，上调呼吸链关键蛋白表达。本试验结果发现，RES能够提高肝脏NRF1 mRNA表达量，表明RES促进仔猪肝脏的线粒体生物合成。线粒体是产生ATP的主要场所，因此，细胞内ATP的含量可以作为检测线粒体功能的重要指标[39]。本研究发现，与NBW比较，LBW显著降低仔猪肝脏ATP含量，进一步验证了LBW仔猪线粒体功能受损；而饲粮补充600 mg/kg RES提高LBW哺乳仔猪肝脏ATP含量，说明RES对LBW仔猪线粒体能量代谢产物ATP的产生有调节作用。

4 结论

与NBW仔猪相比，LBW仔猪血清和肝脏抗氧化能力下降，线粒体代谢功能受阻；而饲粮添加600 mg/kg RES显著提高LBW仔猪肝脏抗氧化能力，改善线粒体功能。