壳聚糖复合止血海绵的制备及其在硅胶球囊中的应用

汤瑞明 耿在云 宋亮 王超

【摘 要】当前，越来越多的女性推迟了结婚与生育，大龄产妇明显增多，产后出血已成为妇女生育后常见的一种现象。宫腔物理球囊填塞可成功控制90%以上的严重产后出血，因此研究开发新型宫内止血球囊器械具有重要意义。为进一步提高止血球囊的止血效果，文章就研究开发的硅胶止血球囊表面包覆壳聚糖止血海绵的止血性质进行一系列探讨，具体包括止血海绵的制备、微观结构分析、吸水率测定、凝血性能测定、细胞毒性测试等，研究结果表明，文章制备的壳聚糖/海藻酸盐复合止血海绵具有良好的止血效果，可用于新型止血球囊表面包覆。

【关键词】壳聚糖;海藻酸盐;白芨;海绵;止血

0 引言

随着我国全面二孩政策的实施，大龄产妇明显增多，产后出血已成为妇女生育后常见的一种现象[1]。目前，如何降低产后出血量，已经成为广大医生与医疗器械生产制造企业不懈的共同追求目标。治疗产后出血的方法包括药物保守治疗、盆腔血管结扎法、改良式B-Lynch子宫背带式缝合、血管性介入治疗和物理子宫填塞压迫止血等[2-3]。其中，宫腔物理球囊填塞可成功控制90%以上的严重产后出血[4-5]。由于该止血方法具有操作简单、对孕产妇危害小、费用低、安全快速、术后康复快等优点，因此研究开发新型宫内止血球囊器械具有重要意义。为进一步提高止血球囊的止血效果，本文就江苏瑞京科技发展有限公司研究开发的硅胶止血球囊表面包覆壳聚糖止血海绵的止血性质进行一系列探討，为开发具有更好的止血球囊创造条件。

1 实验材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 主要材料试剂

壳聚糖（简称CS），中等黏度，购自阿拉丁试剂公司;海藻酸钙（简称Alg-Ca）：自己制作多孔微球;白芨多糖（简称BSP）：实验室自己提取;戊巴比妥钠（P3790），购自SECOMA公司;戊二醛25%，购自科密欧化学试剂公司;胎牛血清，Procell公司;DMEM培养液，购自Procell公司;小鼠胚胎成纤维细胞3T3，购自Procell公司。

1.1.2 主要仪器

冷冻干燥机，型号为LGJ-10C，由四环科学仪器公司制造;冷冻离心机，由日本日立公司制造;S-4800型扫描电子显微镜，由日本日立公司制造;生物数码显微镜，型号为MC-1180，由蔚仪金相试验仪器公司制造;iMark酶标仪，由Bio-RAD公司制造。

1.2 复合海绵的制备

称取一定量壳聚糖加到100 mL 1%醋酸溶液中，静置脱泡，获得壳聚糖醋酸溶液。

称取一定量海藻酸钙，按5%、10%、15%、20%的质量分数，加入到以上的壳聚糖溶液中，搅拌均匀，即得到CS/Alg-Ca混合溶液。

称取一定量白芨多糖，按2.5%、5%、7.5%、10%质量分数，加入到以上的上述壳聚糖/海藻酸钙溶液中，搅拌均匀，即得到CS/Alg-Ca/Bsp溶液。

CS/Alg-Ca复合海绵制备：准确称取一定量壳聚糖溶液，加入5%、10%、15%、20%的Alg-Ca海藻酸钙微球，于-70 ℃温度下冷冻干燥，得到CS/Alg-Ca复合海绵。

1.3 微观结构分析

按照扫描电子显微镜的制样方法制作样品，然后在合适的放大倍数下观察样品微观结构。

1.4 复合海绵吸水率测定

将复合海绵裁成长方条，干燥至恒重，称重标记为W0。样条放入含生理盐水烧杯中，浸泡3 min，沥水1 min，吸掉表面的水分，称重标记为Wt。吸水率按如下公式计算：吸水率=Wt-W0/W0×100%

1.5 复合海绵的凝血测试

根据Shih MF方法，用全血凝血指数BCI进行评根据Shih MF方法，用全血凝血指数BCI进行评价。用紫外分光光度计在波长545 nm处测其吸光度。BCI计算方法如下：

BCI=A样品/A空白×100%

1.6 复合海绵对凝血酶原时间（PT）的影响

取各种复合海绵与壳聚糖海绵，在紫外灯下灭菌，然后测定PT。

在37 ℃恒温水浴中，待测样品孵育3 min，加入0.1 mL血浆，吸收后，加入0.2 mL的37 ℃预温PT试剂，开始计时，到出现丝状物即停止计时，记录成丝时间，即为PT。

1.7 溶血率测定

材料的溶血率根据GB/T 14233.2—2005的要求进行测试。计算公式如下：

溶血率=（B样品-B阴性）/（B阳性-B阴性）×100%

1.8 细胞毒性的测定

采用CCK-8法，测试复合海绵对3T3细胞的细胞毒性。根据GB/T 16886.5—2003的规定，计算细胞相对增殖率（RGR）：

RGR=OD（实验组）/OD（对照组）×100%

1.9 动物止血评价

本文采用动脉血管为出血模型。将大鼠剥离出股动脉，施以准备好的待测样品，开始计时，直至完全止血，记录止血时间，然后称量止血后的纱布和材料的总重后计算出血量。

2 结果与讨论

2.1 壳聚糖海绵的微观结构分析

图1为壳聚糖和CS/Alg-Ca复合海绵的SEM和生物显微镜图。A1～E1为SEM图，A2～E2为放大40倍观察到的图。

其中，A1、A2为纯壳聚糖;B1、B2为CS/Alg-Ca5;C1、C2为CS/Alg-Ca10;D1、D2为CS/Alg-Ca15;E1、E2为CS/Alg-Ca20;F为纯壳聚糖;G为复合海绵。

从图1可以看到，所得海绵具有蜂窝状的多孔结构且相互连通，主要结构显示为片状结构，如果加入多孔微球，海绵结构没有受到太大影响，微球主要黏附在片层上。随着微球量的增加，位于海绵表面和内部的微球数量也增多，出现了团聚现象。这是因为壳聚糖是带正电性的多糖，微球则带负电荷，通过电荷作用，导致微球出现团聚，从而影响分散。

2.2 壳聚糖海绵的吸水率变化

图2为复合海绵吸水率随着Alg-Ca微球含量变化产生的曲线。曲线显示，随着微球含量的增加，海绵材料的吸水率出现先增加后减小的趋向。这是因为加入微球起到了分子筛的效果，提高了整体吸水性;同时，微球也增加了海绵中亲水成分。数据显示，海藻酸钙含量为10%的复合海绵最大吸水率可以达到4 295.06%。

2.3 壳聚糖海绵的体外凝血分析

从图3可以看出，制备的壳聚糖/海藻酸钙复合海绵的凝血指数较小，并且逐渐随着微球含量增加而减小。纯壳聚糖的凝血指数是63.15%，CS/Alg-Ca5的凝血指数是47.80%，CS/Alg-Ca10的凝血指数是42.05%，CS/Alg-Ca15的凝血指数是33.09%，CS/Alg-Ca20的凝血指数是30.39%。CS/Alg-Ca/Bsp10的凝血指数最小为22.41%。分析认为，微球可以不断放出钙离子，能够激活凝血因子。白芨多糖能够有效缩短凝血酶原时间，促进血小板的凝集。所以，三元复合海绵的凝血效果比二元复合海绵的凝血效果更好。

2.4 组成不同的海绵对PT的影响

表1为不同组成比例对PT的影响效果，纯壳聚糖差别不大，表明壳聚糖凝血不同于海藻酸钙凝血。由于海藻酸钙微球释放出的Ca2+作用的结果，CS/Alg-Ca10复合海绵对PT影响较小，而含白芨多糖的三元海绵对PT影响显著，并且随多糖量的增加，PT值呈现较少趋势。因此可以证明，CS/Alg-Ca/Bsp三元复合海绵可以有效提高凝血速率。

2.5 壳聚糖海绵的溶血率

表2为检测材料与新鲜抗凝血作用后红细胞释放的血红蛋白量。除了纯壳聚糖，其他所有的复合海绵的溶血率均能够达到标准要求的溶血率小于5%的数值，符合医疗器械中生物材料对溶血的要求。

2.6 海绵材料细胞毒性测试结果

采用CCK-8方法测试的复合海绵对小鼠胚胎成纤维细胞3T3的相对增殖率如图4所示，可以看出，各组成比例下，细胞相对增殖率都超过90%，之间无明显差异。加入白芨多糖，细胞相对增殖率则都超过100%，表明海绵材料的细胞毒性为零级，均有利于细胞的生长，对创伤的愈合起到促进作用。

2.7 壳聚糖海绵的动物出血模型止血效果

图5为SD鼠股动脉出血模型，表3为不同复合海绵的止血测试结果，数据显示，三元复合海绵的止血效果最好，其次是二元复合海绵，最后是纯壳聚糖与明胶制作海绵。更进一步看出，白芨含量为10%的三元复合海绵的止血效果最佳，出血量最少，其与纯壳聚糖相比，止血效率提升了47.3%，与CS/Alg-Ca10海绵相比，也提升了39.3%，比明胶海绵也提升了41.7%。这充分表明，壳聚糖、海藻酸钙微球和白芨多糖产生了协同作用，能够更有效止血。

2.8 止血机理分析

壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性，在生物医用敷料、药物载体等领域获得较多应用。从他人文献可以看到，壳聚糖的分子结构中的第二个碳上带有氨基，在酸性条件可以接受一个质子，成为带正电荷的铵离子，而红细胞是带负电荷的，通过电荷作用，能够使红细胞聚集在创口，可以激活凝血系统，从而实现止血[6-9]。海藻酸盐最大可吸收自身重量的20倍水分，海藻酸钙多孔微球则是通过放出其所含的钙离子，与凝血系统分数作用，刺激形成纤维蛋白原，从而吸附红细胞，达到止血效果[10-12]。白芨多糖是依靠其能够促进血小板凝集，并且缩短凝血酶原时间，从而达到凝血作用。因此，本文通过将海藻酸钙多孔微球、白芨多糖、壳聚糖复合，获得一种新型的海绵材料，通过提高材料吸水性能，同时提升了材料的止血性能，可作为新型止血材料应用于生物医学领域。

3 结论

通过对复合海绵的理化性能、生物学性能和止血性能进行评价，得出如下结论。

（1）复合海绵中掺入白芨多糖，能够有效缩短凝血酶原时间，提高止血速度，容易实现快速地止血。

（2）凝血指数BCI值结果表明，微球含量和白芨多糖含量高的复合海绵的凝血效果较佳，动物止血实验表明，白芨多糖含量越高，复合海绵止血时间越短，出血量越少。

（3）通过溶血率、全身急性毒性实验等分析，本研究制备的三元复合海绵具有良好的生物相容性。

参 考 文 献

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