骨髓间充质干细胞对脓毒症新生大鼠肺损伤的影响及其机制

兰江丽 梁秋梅 冯继峰 郑剑秋

(广西壮族自治区妇幼保健院麻醉科，南宁市 530000，电子邮箱：70588175@qq.com)

脓毒症是外界病原微生物感染造成的全身性炎症反应综合征，可快速进展为脓毒性休克和多器官功能障碍综合征(multiple-organ dysfunction syndrome，MODS)，其中肺是脓毒症的主要靶器官[1-3]。新生儿免疫系统发育不完善，极易受到病原微生物感染，易诱发脓毒症，而脓毒症易进展为脓毒症休克和MODS，危及患儿的生命[4]。研究表明，骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)具有抗炎、抗凋亡、免疫调节和组织修复等功能[5-6]，能够显著抑制脓毒症肺损伤和MODS的炎症反应，但具体调节机制尚不清楚。本研究通过建立脂多糖诱导的新生大鼠脓毒症肺损伤模型，探讨BMSC移植对脓毒症肺损伤炎症反应的影响及其可能机制，为新生儿脓毒症肺损伤的治疗和干预提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及设备 磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)和杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)培养基、脂多糖购自美国Sigma-Aldrich 公司(批号：P3288,51435C，SMB00610)；10%特级胎牛血清购自美国HyClone公司(批号：SH30084.03)；白细胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α 酶联免疫吸附检测试剂盒购自武汉华美生物工程有限公司(批号：CSB-E08055r、CSB-E04640r、CSB-E11987r)；TRIzol 购自上海碧云天生物技术有限公司(批号：R0016)，反转录试剂盒PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)、PCR TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒均由日本Takara公司生产(批号：RR037A、RR820A)；肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)、核因子κB(nuclear factor kappaB,NF-κB)/p65、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司(批号：13377、14694、8242、5174)；辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)标记的山羊抗兔IgG购自美国Proteintech Group公司(批号：SA00001-2)，电化学发光试剂盒购自碧云天公司(批号：P0018S)。UV-2100PC型紫外可见分光光度计由美国Unico公司生产，Mx3000P实时荧光PCR仪由美国Agilent生物技术有限公司生产，Tans-Blot®Turbo全能型蛋白转印系统及ChemiDocTMMP全能型成像系统由美国Bio-Rad®生物技术有限公司生产。

1.2 实验动物 出生1 d的无特定病原体级SD大鼠60只，雌雄不限，体质量20～25 g，由广东省医学实验动物中心提供，动物合格证号：SYXK(粤)-2014-0002。4周龄的无特定病原体级SD大鼠20只，雌雄不限，体重约250 g，均购自广西医科大学医学实验动物中心，动物合格证号：SCXK(桂)2019-0002，实验前均在动物饲养室驯养两周，室温为(25±1)℃，动物自由进食和饮水，并定时更换垫料。

1.3 BMSC的提取与培养 采用文献[7]的方法进行BMSC的提取与培养。取4周龄的SD大鼠，采用引颈法处死，75%乙醇浸泡5 min后解剖分离出大鼠的股骨和胫骨，浸泡在含有双抗的DEME培养基中。用含10%特级胎牛血清的低糖DMEM培养液反复冲洗股骨和胫骨骨髓腔，获得细胞悬液约4 mL，4℃下1 200 r/min离心5 min后接种于含DEME培养基的细胞培养瓶中，放置于37℃、5% CO2的培养箱进行原代培养。48 h后换液，去除未贴壁细胞，原代细胞贴壁80%～90%后传代培养。取第4代BMSC用于本实验。

1.4 脓毒症模型制备及干预方法 按照随机数字表法，将新生SD大鼠随机分为对照组、脓毒症组和脓毒症+BMSC处理组(BMSC组)各20只。脓毒症组和BMSC 组大鼠，经腹腔注射脂多糖(1 mg/kg)构建脓毒症模型[8]，对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。BMSC组在建模后2 h内经腹腔输注0.5 mL的BMSC (1×105个细胞/只)，其余两组大鼠输注等量生理盐水。建模后24 h处死大鼠，暴露胸腔，经右心室取血，4℃下1 800 r/min 离心15 min后取血清；结扎右肺，用预冷的PBS反复灌洗，收集支气管肺泡灌洗液(bronochoalveolar lavage fluid,BALF)。-80℃保存血清、BALF和肺组织待检。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

1.5 肺组织湿/干比的计算及病理学观察 取右肺中上叶组织称取湿重，置60℃烘干箱48 h后称取干重，计算湿/干比。取右肺下叶组织以10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋切片及苏木精-伊红染色，光镜下观察肺组织病理学改变并评分。评分内容包括肺泡充血、出血、白细胞渗出到肺泡腔或血管壁和肺泡壁损伤，均按照 0～4分进行评分[9]，其中少量轻微损伤为0分，轻度损伤为1分，中度损伤为2分，重度损伤为3分，严重损伤为4分。

1.6 血清及BALF中炎症因子含量的检测 采用酶联免疫吸附法检测血清和BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，均按照试剂盒说明书进行操作。

1.7 肺组织TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA表达的检测 采用TRIzol法提取左肺上叶组织总RNA，UV-2100PC型紫外可见分光光度计测定RNA浓度和纯度，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，均严格按照试剂盒说明书进行操作。采用实时荧光定量PCR检测TNFR1、VCAM-1、NF-κB/65 RNA的表达水平，反应体系包括2×One Step TB Green RT-PCR Buffer 4 15 μL、PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 2.0 μL、PCR上游引物(10 μM)2.0 μL、PCR下游引物(10 μM)2.0 μL、ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)1.0 μL、cDNA 4.0 μL和RNase Free dH2O 4 μL，总体积为30 μL。反应条件：95℃预变性30 s；90℃ 3 s，60℃ 30 s，40个循环。TNFR1上游引物5′-TGAGACGCATTTCCAGTGTG-3′，下游引物5′-AGAATCCTGCGTGGCAGTTA-3′；VCAM-1上游引物5′-CTACATCCACACTGACGCTGAG-3′，下游引物5′-CAGGGAATGAGTAGACCTCCACTT-3′，NF-κB/p65上游引物5′-GATGGGACGACACCTCTACACATA-3′，下游引物5′-CCCAAGAGTCGTCCAGGTCA-3′；内参GAPDH上游引物5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物5′-ATGGTGGTGAGACGCCAGTA-3′。引物均由日本TaKaRa公司合成。采用相对定量法2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达水平。

1.8 蛋白质免疫印迹检测肺组织TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65蛋白表达 采用RIPA和PMSF(按1 mL RIPA/10 μL PMSF/100 mg组织的比例配制)提取左肺下叶组织总蛋白，并采用二喹啉甲酸法测定蛋白浓度后，经变性、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜及封闭(5%脱脂奶粉封闭液，摇床震动下室温封闭1 h)后，分别以多克隆TNFR1(1 ∶1 000)、VCAM-1(1 ∶1 500)、NF-κB/p65(1 ∶1 000)和GADPH抗体(1 ∶1 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜后采用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG室温孵育1 h。经电化学发光试剂盒显影及ChemiDocTMMP 全能型成像系统成像后，测定目的蛋白的灰度值，以目的蛋白与GADPH蛋白灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

1.9 统计学分析 采用SPSS 13.0进行统计学分析。正态分布计量资料以(x±s)表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组大鼠肺组织湿/干比比较 与对照组比较，脓毒症组和BMSC组大鼠肺组织湿/干比增加(均P<0.05)；与脓毒症组比较，BMSC组大鼠肺组织湿/干比降低(均P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠肺组织湿/干比和病理学评分比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与脓毒症组比较，#P<0.05。

2.2 3组大鼠肺组织病理学改变和评分 对照组大鼠肺组织无明显病理学改变；脓毒症组大鼠肺组织结构紊乱，肺间质显著充血水肿，肺泡内大量炎症细胞和红细胞渗出；BMSC组大鼠肺组织结构轻度紊乱，肺间质部分充血水肿，肺泡可见少量炎症细胞和红细胞渗出。与对照组比较，脓毒症组和BMSC组大鼠肺组织病理学评分均增加(均P<0.05)；与脓毒症组比较，BMSC组大鼠肺组织病理学评分降低(均P<0.05)。见表1和图1。

对照组 脓毒症组 BMSC组图1 光镜下3组大鼠肺组织病理学改变(苏木精-伊红染色，×100)

2.3 3组大鼠血清及BALF中炎症因子水平比较 对照组、BMSC组、脓毒症组大鼠血清及BALF中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均依次升高(均P<0.05)，见表2。

表2 3组大鼠血清和BALF中IL-1β、IL-6和TNF-α水平的比较(x±s)

注：与对照组比较，*P<0.05；与脓毒症组比较，#P<0.05。

2.4 3组大鼠肺组织TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA和蛋白表达水平比较 对照组、脓毒症组、BMSC组肺组织TNFR1蛋白及mRNA相对表达水平依次升高；对照组、BMSC组、脓毒症组肺组织VCAM-1和NF-κB/p65 蛋白及mRNA相对表达水平依次升高 (均P<0.05)，见表3和图2。

表3 3组肺组织中TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65 mRNA和蛋白表达水平比较(x±s)

注： 与对照组比较，*P<0.05；与脓毒症组比较，#P<0.05。

图2 3组大鼠肺组织中TNFR1、VCAM-1和NF-κB/p65蛋白的表达

3 讨 论

本实验使用脂多糖建立脓毒症大鼠模型，脓毒症组大鼠血清及BALF中细胞因子IL-1β、IL-6与TNF-α表达明显上调，肺组织水肿并出现明显的病理学改变，提示新生大鼠的脓毒症模型建模成功。BMSC是再生医学中常用的干细胞，具有抑制炎症、改善凝血功能、调节免疫反应、促进缺血组织和血管再生等生物学效应[10-13]。本实验探讨了BMSC对脂多糖所致脓毒症新生大鼠肺损伤及炎症反应的影响。结果显示，与脓毒症组比较，BMSC组大鼠的肺组织湿/干比降低(P<0.05)，肺组织病理学改变减轻，提示BMSC能够促进新生大鼠脓毒症肺损伤的修复；同时，BMSC组大鼠的细胞因子IL-1β、IL-6与TNF-α水平低于脓毒症组(P<0.05)，提示BMSC可抑制炎症细胞因子IL-1β、IL-6与TNF-α的释放，调节机体促炎与抗炎反应的平衡，从而促进肺损伤的修复。

TNFR1是由单核细胞分泌的蛋白水解蛋白，其胞外结构域可识别TNF-α并与之结合[14]。有学者应用TNF-α或脂多糖上调人间充质干细胞的可溶性TNFR1表达后，发现TNF-α的生物学效应被抑制，提示TNFR1是TNF-α的负反馈机制之一[15]。Yagi等[16]研究发现，BMSC通过激活并释放可溶性TNFR1而抑制脂多糖引起的过度炎症反应和多个靶器官蛋白水解损伤。本研究中，与对照组大鼠相比，脓毒症组大鼠接受LPS刺激后TNFR1表达上调，但未达到抑制炎症因子释放的水平；与脓毒症大鼠比较，BMSC处理后脓毒症新生大鼠肺组织的TNFR1表达上调，而血清及BALF中TNF-α水平降低(P<0.05)，提示BMSC治疗新生大鼠脓毒症肺损伤的机制可能是通过上调TNFR1表达而抑制TNF-α等炎症因子释放。

VCAM-1是表达在内皮细胞、平滑肌细胞和骨髓基质细胞等细胞表面的糖蛋白，水解后形成具有生物活性的片段即可溶性VCAM-1[17]。研究表明，TNF-α可刺激免疫活性细胞分泌IL-1β和IL-6等炎症因子，诱导血管内皮细胞表达VCAM-1，促进白细胞黏附在血管内皮而引起血管内皮损伤[18-19]。王春苗等[20]发现，TNF-α预处理可明显提高BMSC的VCAM-1表达及迁移黏附能力，将TNF-α预处理的BMSC移植于心肌梗死模型大鼠后，大鼠左心室功能增加而梗死心肌细胞的胶原沉积。本研究的结果显示，BMSC组大鼠肺组织VCAM-1 mRNA和蛋白均较脓毒症组大鼠降低(P<0.05)，提示BMSC或可通过抑制白细胞黏附在血管内皮而减轻血管内皮损伤。

NF-κB/p65介导的信号通路如Toll样受体、蛋白激酶B/腺苷酸激活蛋白激酶参与脓毒症肺损伤炎症反应的调控[21-23]。Yagi等[16]研究发现，在炎症因子刺激激活的上皮细胞中，BMSC可抑制其NF-κB的激活。本研究结果显示，BMSC移植后脓毒症新生大鼠肺组织NF-κB/p65表达较脓毒症新生大鼠降低(P<0.05)。因此，BMSC减轻脂多糖肺损伤及炎症反应的机制可能与NF-κB/p65表达受抑制有关。

综上所述，BMSC可有效减轻新生大鼠脓毒症肺损伤及炎症反应，从而促进损伤肺组织的修复，改善器官功能。BMSC减轻新生大鼠脓毒症肺损伤的机制可能有以下几点：(1)上调TNFR1表达而抑制TNF-α等炎症因子释放；(2)降低VCAM-1表达，抑制白细胞的迁移和黏附；(3)降低NF-κB/p65的表达，抑制炎症信号通路的传导。本研究结果或可为临床上新生儿脓毒症肺损伤的治疗提供实验参考依据。