乙醇沉淀法提取二倍体马铃薯淀粉*

段思凡， 唐飞， 杨慧芹， 杨玉玲， 马玲

(云南师范大学 生命科学学院,马铃薯科学研究院，云南 昆明 650500)

马铃薯(SolanumtuberosumL.)是世界上继水稻和小麦后的第三大粮食作物[1-2].马铃薯块茎中淀粉含量在植物淀粉中位居第二位[3]，淀粉是构成马铃薯块茎干物质的主要成分.马铃薯淀粉具有粉质白净、黏度高、糊化温度低及支链淀粉含量高等特点[4]，因此目前市场上马铃薯淀粉的消费量仅次于玉米淀粉[5]，被广泛应用于食品、化工、纺织、医药和饲料等行业，具有巨大的商业价值[6].我国马铃薯加工业中存在淀粉提取率低和品质不良等方面的不足，制约了我国马铃薯淀粉加工业的发展.

关于植物淀粉的提取方法国内外已有相应的报道，主要的提取方法有酸液浸泡法[7]、表面活性剂法、酶提法[4,8-9]、超声波辅助提取[10]、水提法[11-12]和碱提法[13-14]等.许力等[15]研究了实验室马铃薯淀粉提取工艺及其影响因素，王国扣[16]研究了影响马铃薯淀粉提取率的主要因素，认为淀粉提取率不仅与工艺条件有关，而且与马铃薯淀粉含量有关；陈立胜等[17]研究了粉碎方法对淀粉提取率的影响.

以上提取方法主要针对传统四倍体栽培种马铃薯，二倍体马铃薯与四倍体马铃薯相比，其淀粉含量、直链淀粉含量及淀粉颗粒特性等方面均存在明显差异.已有的淀粉提取方法在提取二倍体马铃薯淀粉时存在成本高且效率低等弊端.为了探索二倍体马铃薯淀粉的提取工艺，参考文献方法[18-20]，对乙醇沉淀法提取二倍体马铃薯淀粉工艺条件及淀粉颗粒进行了研究，以期缩减大批量淀粉提取测定的时间与工作量，为在淀粉工业领域应用提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

从国际马铃薯中心引入的二倍体马铃薯材料C系列编号的组培苗，扩繁后，于2019年3月种植于云南省昆明市寻甸县六哨乡，7月收获薯块.从中挑选无病害、无发芽且无腐烂的新鲜薯块用于优化二倍体马铃薯的淀粉提取工艺；马铃薯直链淀粉标准品S11003(上海源叶生物科技有限公司)，碘化钾(上海国药集团化学试剂有限公司)，碘(上海国药集团化学试剂有限公司)，氢氧化钾(上海埃彼化学试剂有限公司)，盐酸(上海国药集团化学试剂有限公司)，95%乙醇(上海国药集团化学试剂有限公司).

1.2 仪器与设备

冷冻干燥机(coolsafe 110-4型,丹麦Labogene公司)，酶标仪(VersaMax型,Molecular Devices公司)，pH计(S220-K型,上海巴玖实业有限公司)，磁力搅拌器(MYP11-2型,上海右一仪器有限公司)，电子分析天平(JD200-3型,沈阳龙腾电子有限公司)，光学显微镜(OLYMPUS-bx43f型,南京贝登电子商务有限公司)，组织破碎仪(DS-1型,上海右一仪器有限公司)，榨汁机(WJE2802D型,Midea公司).

1.3 方法

1.3.1 乙醇沉淀法提取二倍体马铃薯淀粉

按照新鲜二倍体马铃薯→清洗→破碎→汁渣分离→乙醇沉降→干燥→淀粉成品的技术流程，进行二倍体马铃薯淀粉的提取.具体的操作如下：将二倍体马铃薯鲜薯洗净削皮切块混匀后称重，记录.利用组织破碎仪对块茎进行频率为50 Hz的组织破碎5 min，块茎初步破碎后转入榨汁机进行汁渣分离处理，收集汁液.所得的粗渣用50 mL蒸馏水进行2遍滤洗得到滤洗液.将滤洗液和收集的汁液进行混合，得到淀粉粗提液.调节淀粉粗提液的pH至6.0，静置10 min后加入95%乙醇加速淀粉沉淀.弃上清液，沉淀即为淀粉，湿淀粉用20 mL蒸馏水进行洗涤，共洗涤三次，弃洗液.洗涤完后将淀粉沉淀置于-80 ℃冰箱12 h后，对湿淀粉进行冷冻干燥处理48 h，获得淀粉制品.

1.3.2 乙醇沉淀法提取二倍体马铃薯淀粉单因素试验

鲜薯重量、乙醇终浓度和蒸馏水洗涤次数影响了二倍体马铃薯淀粉的提取率.对鲜薯重量、乙醇终浓度和蒸馏水洗涤次数分别设置三个参数，按照1.3.1中列出的二倍体马铃薯淀粉提取方法，分别确定淀粉提取率的最佳参数.

1.3.3 淀粉提取正交试验

通过单因素试验确定上述三个因素的最佳参数后，以此为基础进行3因素3水平L9正交试验.见表1，确定乙醇沉淀法提取二倍体马铃薯淀粉的最佳工艺参数.

根据二倍体马铃薯淀粉性质与预实验结果，以乙醇终浓度(A)、鲜薯重量(B)和洗涤次数(C)三个因素，分别设立三个水平，利用L9正交试验设计优化提取二倍体马铃薯淀粉的工艺参数.

表1 L9因素水平

1.3.4 直链淀粉含量的测定

采用双波长比色法测定直链淀粉含量[18,21-24].

样品直链淀粉含量的测定：称取样品0.100 0 g至50 mL离心管中，加入10 mL 0.5 mol/L KOH，沸水浴20 min混匀反应，双蒸水50 mL进行定容.吸取定容后的样品液2.5 mL至新的50 mL离心管中，加入双蒸水25 mL混匀，0.1 mol/L HCl调节pH至3.5，加入0.5 mL的碘—碘化钾，双蒸水定容至50 mL刻度线.定容后的混合液常温静置25 min(三次重复).每一个编号取反应液250 μL重复于96孔微型板中，进行双波长535～570 nm的测定(三次重复求平均值)，利用公式计算出直链淀粉含量的百分比.

W：直链淀粉含量/%；M为样品质量/g；X为淀粉含水量/g；10为单位换算系数，A570nm为570 nm波长处混合液的吸光度值，A535nm为534 nm波长处混合液的吸光度值.

1.3.5 淀粉颗粒的观察

利用光学显微镜对与碘-碘化钾结合的淀粉颗粒进行形态大小观察.将二倍体马铃薯淀粉样品0.1 g与1 mL双蒸水混合调成淀粉乳，取一滴淀粉乳滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于光学显微镜的载物台，选择适宜的光亮度，在10×的目镜及20×和40×的物镜下进行观察并拍照.

1.4 数据处理

所有的实验数据均采用SPSS 19.0和Excel进行处理及分析.

2 结果与分析

2.1 单因素对二倍体马铃薯淀粉提取率的影响

2.1.1 乙醇终浓度对二倍体马铃薯淀粉提取率的影响

为确定乙醇终浓度对淀粉提取率的影响，称取50 g去皮清洗干净的新鲜二倍体马铃薯薯块按1.3.1的提取工艺进行提取.将蒸馏水洗涤次数设置为3次,分别计算不同乙醇终浓度条件下，二倍体马铃薯淀粉提取率的变化，结果见图1.可以看出随着淀粉粗提取液中乙醇终浓度的增加，淀粉提取率增高，但是超过30%后，淀粉提取率快速降低，乙醇终浓度为30%时，获得的淀粉提取率较高.

图1 不同乙醇终浓度对淀粉提取率的影响

2.1.2 鲜薯重量对二倍体马铃薯淀粉提取率的影响

为了确定鲜薯重量对淀粉提取率的影响，在乙醇终浓度为30%，蒸馏水洗涤次数设置为3次的前提下，考察鲜薯重量分别为30、40 g和50 g时，二倍体马铃薯淀粉提取率的变化.结果见图2，二倍体马铃薯淀粉的提取率随着薯块鲜重的减少，缓慢降低，当二倍体马铃薯鲜重为50 g时，淀粉的提取率最高.

图2 不同鲜薯重对淀粉提取率的影响

Fig.2 Influence of different fresh potato weights on starch yield

2.1.3 淀粉洗涤次数对二倍体马铃薯淀粉提取率的影响

为了确定蒸馏水洗涤次数对淀粉提取率的影响，在鲜薯重量为50 g，乙醇终浓度为30%的前提下，考察不同洗涤次数对淀粉提取率的影响.如图3所示，随着蒸馏水洗涤次数的增高，淀粉提取率显著降低，因此为了获得最高的二倍体马铃薯淀粉提取率，蒸馏水的洗涤次数应为3次.

图3 不同洗涤次数对淀粉提取率的影响

Fig.3 Influence of different washing times on starch yield

2.2 二倍体马铃薯淀粉提取工艺影响因素的优化研究

为了确定乙醇终浓度、鲜薯重量和蒸馏水洗涤次数这三个因素之间对二倍体马铃薯淀粉提取率是否存在相互影响，并确定乙醇沉淀法提取二倍体马铃薯淀粉的最适提取参数，设计了三因素三水平正交实验，统计结果如表2所示.其中A因素代表乙醇终浓度，分别设置为20%、30%和50%；B因素代表用于提取淀粉的鲜薯重量，设置30、40 g和50 g三个参数；C因素代表淀粉提取过程中，蒸馏水的洗涤次数，分别设置3、4次和5次.通过对淀粉提取率正交实验结果评价，得出淀粉提取率的最佳条件组合为A2B2C1.即乙醇终浓度为30%，鲜薯重为50 g，洗涤次数为3次时，二倍体马铃薯淀粉提取率为10.94%.从极差R的大小可见，各因素对淀粉提取的影响作用顺序为乙醇终浓度>洗涤次数>鲜薯重量.

表2 正交实验统计结果

从表3可知，乙醇终浓度的F=396.94，P=0.003<0.01，差异极显著；鲜重的F=75.43，P=0.013<0.05，差异显著；洗涤次数的F=89.07，P=0.011<0.05，差异显著.F检验结果表明，二倍体马铃薯淀粉在提取过程中，乙醇终浓度、鲜重及洗涤次数三个因素均对二倍体马铃薯淀粉提取率有显著影响.

表3 淀粉提取率方差分析

a:R2= 0.998

2.3 马铃薯淀粉颗粒形态与大小

不同马铃薯的淀粉颗粒形态差异可通过染色后在光学显微镜下清晰辨别.马铃薯淀粉颗粒形态上大多数为椭圆形，大小范围在20～100 μm[25-26].不同植物来源的淀粉颗粒因其遗传性和生长环境条件的差异而具有不同的大小、形状(球形、椭圆形、多面体和不规则形)及粒径分布[27].

在光学显微镜下，观察四倍体和二倍体马铃薯的淀粉颗粒，如图4所示，淀粉颗粒经碘-碘化钾染液染色后呈蓝紫色，二倍体马铃薯的淀粉颗粒相比于四倍体，其颗粒分布更为松散，直径较小，且不规则形状的淀粉颗粒比例增高.

A:200×放大倍数下四倍体马铃薯淀粉颗粒;B:200×放大倍数下二倍体马铃薯淀粉颗粒;C:400×放大倍数下四倍体马铃薯淀粉颗粒;D:400×放大倍数下二倍体马铃薯淀粉颗粒

图4 光学显微镜下淀粉颗粒的形态与大小

Fig.4 Morphology and size of starch granules under optical microscope

3 讨 论

马铃薯淀粉深加工产品的开发是提高马铃薯在产业链中价值的重要环节，建立有效的淀粉提取工艺对于发展马铃薯淀粉产业至关重要.对马铃薯淀粉提取工艺的研究一直是工业研究的热点，王大为[10]、许力[15]及陈立胜[17]等人研究了马铃薯淀粉的提取工艺及其影响因素，但未对提取到的马铃薯淀粉颗粒形态做进一步观察.淀粉颗粒的结构形态是研究淀粉加工性能的基础，淀粉颗粒的差异影响着淀粉的加工[28].因此，提高淀粉提取效率的同时也要注重观察淀粉颗粒的形态变化.传统的马铃薯淀粉提取工艺主要针对四倍体马铃薯，且易造成淀粉颗粒形态发生改变.研究采用乙醇沉淀法进行二倍体马铃薯淀粉的提取，利用正交试验设计L9确定乙醇沉淀法的三个工艺参数(乙醇终浓度、鲜薯重量和洗涤次数)的最优条件组合.采用乙醇沉淀法提取的淀粉颗粒经碘染后，显微镜下观察发现淀粉颗粒的形态正常，无破损，说明乙醇沉淀法具有稳定淀粉颗粒形态的优点.

在单因素试验的基础上，通过正交试验设计组合具有代表性的9组试验进行分析，得出乙醇沉淀法提取二倍体马铃薯淀粉的最佳工艺参数组合为：乙醇终浓度为30%，鲜薯重为50 g，洗涤次数为3次.乙醇终浓度的高低对淀粉提取率影响较大.适宜的乙醇终浓度能够提高二倍体马铃薯淀粉的提取效率，材料重量对淀粉提取率具有一定的影响；利用碘-碘化钾染色法对不同倍性马铃薯颗粒进行观察，淀粉颗粒形态正常无破损，二倍体马铃薯淀粉颗粒与四倍体马铃薯淀粉颗粒相比直径较小.

综上所述，研究筛选出了适合二倍体马铃薯淀粉提取的最适乙醇终浓度、鲜薯重量及洗涤次数，并发现二倍体马铃薯淀粉颗粒与四倍体的相比存在明显区别，研究结果可为针对二倍体马铃薯淀粉的生物学研究提供有益参考.