QuEChERS萃取-UPLC-MS/MS测定花生酱中黄曲霉毒素B1方法的研究

梁剑锋，李亚，梁燕妮，杨韶平

(梧州学院 化学工程与资源再利用学院，广西 梧州 543002)

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉等真菌毒素，在高温高湿环境下产生的一种次生代谢物[1,2]。目前发现有20种黄曲霉毒素及其衍生物 ,其中以黄曲霉毒素B1毒性最强[3]，在1993年被国际癌症研究机构列为Ⅰ类致癌物，对广大人民群众的健康产生巨大危害[4]。花生是我国广泛种植的经济作物，以花生为原料加工的食品除了花生油外，还有调味品花生酱，由于其风味、香气独特而深受广大群众喜爱，但是花生在种植、运输、储存过程中容易受到黄曲霉和寄生曲霉污染，从而产生强致癌代谢物黄曲霉毒素B1[5]。所以，有必要开展花生酱中黄曲霉毒素B1的快速、准确、经济检测方法，以利于对其食品安全性进行有效控制。

目前，国内食品中的黄曲霉毒素B1常用的检测方法有：酶联免疫(ELISA)法、薄层色谱(TLC)法、气相色谱(GC)法、高效液相色谱(HPLC)法、液质联用仪法、免疫传感法[6-12]。这些检测方法是通过免疫亲和柱净化后，采用保留时间方法对黄曲霉毒素B1定性的，具有操作步骤繁琐、检测成本高、干扰物对结果影响大等缺点。QuEChERS是一种在蔬菜、粮食中农残检测的快速提取方法，可以有效去除提取液中蛋白、脂肪酸、磷脂、糖、色素等杂质，能够有效提高检测回收率[13]。将高效、经济、快速的QuEChERS前处理方法，与高灵敏性、高选择性的超高速液相色谱-质谱联用仪联合起来，建立适用于花生酱复杂基质样品中黄曲霉毒素B1的快速检测方法。

1 试验部分

1.1 仪器与材料

LC1290-QQQ6490超高速液相色谱-质谱联用仪(配电喷雾离子源 ) 美国安捷伦公司；XS105DU天平 瑞士梅特勒公司；ST16R高速冷冻离心机 美国热电公司；Multi Reax涡旋混合器 德国Heidolph公司；Million Q超纯水器 美国Millipore公司。

黄曲霉毒素B1标准品：浓度2.000 μg/mL，农业部环境保护科研检测所；甲酸：色谱纯，美国MREDA公司；乙腈、甲醇：色谱纯，德国MERCK公司；无水硫酸镁：分析纯，西陇科学股份有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷吸附剂：PSA，上海安谱科学仪器有限公司；HC-C18填料：40～63 μm，上海安谱科学仪器有限公司；花生酱：市购。

1.2 样品前处理

称取5.0000 g搅拌均匀的花生酱置于50 mL聚乙烯离心管中，加入20.00 mL 1%甲酸-乙腈溶液摇匀，将离心管置于涡旋混合器上混合5 min，然后在冷冻离心机中5 min(转速4000 r/min，温度4 ℃)，取出后放置至室温，准确吸取1.00 mL离心上清液，置于2.0 mL离心管中(预装有无水硫酸镁、HC-C18、PSA净化试剂)，将离心管置于涡旋混合器上混合5 min后，在4 ℃下以15000 r/min冷冻离心8 min，取上清液过0.22 μm滤膜(初滤液弃去)，将滤液置于液相进样瓶中，供上机测定。

1.3 标准溶液配制

黄曲霉毒素B1标准储备液：吸取黄曲霉毒素B1标准品0.50 mL到10.00 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成100.0 ng/mL的标准储备液，密封存储于-20 ℃冰箱中(不超过1个月)。

黄曲霉毒素B1标准曲线：分别吸取100，200，300，400，500 μL黄曲霉毒素B1标准储备液到10.00 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，分别得到浓度为1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ng/mL溶液。

1.4 色谱条件

流动相：A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈，流动相梯度洗脱程序见表1；色谱柱：C18超高惰性硅胶柱(75 mm×2.1 mm×2.5 μm，ACE UltraCore C18)；柱温：35 ℃；流速：0.35 mL/min；进样量：1 μL。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.5 质谱条件

离子源：ESI+；检测模式：多反应监测(MRM)；雾化器压力：40 psi；毛细管电压：3500 V；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：9 L/min；监测离子对和其他参数见表2。

表2 质谱仪检测参数Table 2 Detection parameters of mass spectrometer

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

花生酱的主要配料是花生仁、白砂糖、氢化油脂、食用盐等，样品中对检测有影响的成分主要是高油(样品中脂肪含量在40%～50%之间)、胶溶性杂质(主要是磷脂、蛋白、糖、食盐成分)、脂溶性杂质(主要是游离脂肪酸、色素)等，因此选择合适的提取溶液，可以降低基体带来的干扰，提高试验的回收率，综合考虑样品基体的特点和分析目标物特性后，试验考察甲醇、酸化甲醇(1%甲酸)、乙腈、酸化乙腈(1%甲酸)、甲醇-乙腈(80∶20，V/V)等不同提取溶剂对试验回收率的影响，试验结果见图1。

图1 不同提取溶液对花生酱样品回收率的影响Fig.1 Effect of different extracting solutions on the recovery rate of peanut butter samples

由图1可知，花生酱样品采用1%甲酸-乙腈溶液提取回收率最好。可能是由于花生酱样品含有大量脂肪，根据“相似相溶”的原理，乙腈能够高效提取脂肪中黄曲霉毒素B1，同时1%甲酸-乙腈中甲酸能够使花生酱中大量磷脂、蛋白等胶体干扰物质在提取过程中通过形成絮凝沉淀物离心去除，减少这些物质对目标分析物的吸附，从而达到进一步提高试验回收率的作用。

2.2 净化盐包配比确定

2.2.1 盐析剂无水硫酸镁使用量

由于花生酱样品在经过1%甲酸-乙腈溶液提取离心后，其上清液中还存在着大量共萃杂质，还会影响对目标分析，所以需要进一步采用盐析的方法去除杂质。本试验通过在净化盐包中添加无水硫酸镁，去除提取液中水溶性杂质，考察无水硫酸镁不同添加量对目标分析物回收率的影响，其结果见图2。

图2 盐析剂无水硫酸镁使用量对回收率的影响Fig.2 Effect of the usage amount of salting-out agent anhydrous magnesium sulfate on recovery rate

由图2可知，随着无水硫酸镁使用量增加，目标分析物黄曲霉毒素B1回收率也在增加，但在无水硫酸镁使用量达到250 mg后，目标物回收率出现了下降，此现象原因分析：由于无水硫酸镁有强结合水的能力，其可以大量吸附提取液中水溶性杂质，同时可以饱和水溶液而使提取液分层，从而提高试验萃取效率，但是大量无水硫酸镁使用后，提取液中无水硫酸镁会出现结块现象，从而导致其与提取液接触的面积减少，同时其吸水过程中产生大量热量使提取液局部迅速升温，从而导致目标分析物的回收率下降，所以净化包中采用250 mg无水硫酸镁比较合适。

2.2.2 净化剂配方考核

图3 净化剂HC-C18使用量对黄曲霉毒素B1回收率的影响Fig.3 Effect of the usage amount of HC-C18 on recovery rate of aflatoxin B1

图4 净化剂PSA使用量对黄曲霉毒素B1回收率的影响Fig.4 Effect of the usage amount of PSA on recovery rate of aflatoxin B1

提取液中除了水溶性杂质外，还有一定量的磷脂、蛋白等非极性杂质，和糖类、脂肪酸等极性杂质影响分析结果，所以净化包中通过采用一定量的HC-C18、PSA净化物质，分别除去提取液中非极性、极性杂质，从而进一步提高试验方法的回收率。本试验考察HC-C18、PSA不同的添加量对花生酱基质提取液的净化效果，以黄曲霉毒素B1回收率为考核的指标，结果见图3和图4。

由图3和图4可知，花生酱样品采用100 mg HC-C18、50 mg PSA净化配方，试验目标分析物黄曲霉毒素B1回收率最高。

2.3 色谱/质谱条件的优化

试验考察纯水、0.1%甲酸溶液分别与乙腈、甲醇组成的流动相，对花生酱样品目标分析物黄曲霉毒素B1保留时间与峰形的影响。

图5 黄曲霉毒素B1标准溶液的MRM质谱图Fig.5 MRM mass spectrogram of aflatoxin B1 standard solution

试验结果表明：流动相采用乙腈洗脱效果明显比甲醇好，同时在ESI+模式时，流动相加入0.1%甲酸溶液时，更容易诱导黄曲霉毒素B1产生[M+H]+，所以试验采用0.1%甲酸-乙腈溶液为色谱的流动相。黄曲霉毒素B1标准溶液的MRM质谱图见图5。

3 试验方法评价

3.1 方法线性考察

以黄曲霉毒素B1标准溶液浓度为横坐标(X)，标准溶液响应值为纵坐标(Y)绘制标准曲线，结果表明黄曲霉毒素B1在1.00～5.00 ng/mL的质量浓度范围内具有良好的线性关系，线性回归方程Y=2110.2X+467.9，拟合度r2为0.9993。

3.2 方法检出限

准确称取样品5.00 g(精确到0.0001 g)，加入150 μL的浓度为1.00 ng/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液。按照1.2的前处理方法处理提取样品，S/N=16.2，图谱见图6。

图6 方法的检出限色谱图Fig.6 Detection limit chromatogram of the method

由于检出限为各化合物的3倍信噪比即S/N=3就被定为最低检出限(LOD)。测得数据显示，检出限目标分析物黄曲霉毒素B1信噪比S/N>3，可以确定方法的检出限在0.03 μg/kg。

3.3 方法的回收率及精密度

在空白的花生酱样品中，分别添加0.50，1.00，5.00，10.0 μg/kg 4个不同水平的黄曲霉毒素B1标准溶液，每个水平测定6次，按照1.2的前处理方法处理样品，结果见表3。

表3 试验方法的回收率与相对标准偏差(n=6)Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of test methods (n=6)

由表3可知，本试验方法的回收率在81.7%～93.5%范围内，相对标准偏差(RSD)为2.4%～5.6%。表明该方法适用于样品花生酱中黄曲霉毒素B1分析，试验方法具有良好的回收率与精密度，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》中回收率和精密度的要求[14]。

3.4 实际样品检测

称取市场上购买的3款花生酱(编号T1、T2、T3)，采用1.2的前处理方法处理，同时采用食品中黄曲霉毒素B1检测国家标准GB 5009.22-2016第一法(液质)、第二法(柱前衍生)、第三法(柱后光化学衍生)进行检测[15]，不同方法检测结果见表4。

表4 本试验方法与国标检测方法检测结果的比较Table 4 Comparison of testing results between this method and international standard testing methods

由表4可知，本文的试验方法检测结果与国标3种方法结果相比相对偏低，但是相对偏差都在5%以下，符合国标GB 5009.22-2016中方法精密度小于20%的要求。本试验方法与目前的国标方法相比：在经济成本上，由于前处理无需价格昂贵的免疫亲和柱净化，减少了检测成本；在检验效率上，QuEChERS前处理过程简单、快捷，易于大批量的花生酱样品检测，具有极高的检测效率。

4 结论

本文建立了QuEChERS萃取-液质联用仪快速检测花生酱中黄曲霉毒素B1的方法，试验采用250 mg无水硫酸镁、100 mg HC-C18、50 mg PSA净化提取包配方后进入液质联用仪检测，方法回收率在81.7%～93.5%范围内，相对标准偏差(RSD)为2.4%～5.6%，检出限为0.03 μg/kg。该方法具有方便、快捷、经济、准确、回收率高等特点，适用于花生酱等容易受到黄曲霉毒素污染的样品检测与质量控制。