免疫亲和柱全自动固相萃取-高效液相色谱法测定粮油中玉米赤霉烯酮

吴 宇 叶 金 李 丽 何建洪 张 峰 李 森 轩志宏 崔 华 王松雪 马海华

(粮油质量安全研究所；国家粮食与物资储备局科学研究院1，北京 100000) (睿科仪器(厦门)有限公司2，厦门 361000) (河南工业大学信息科学与工程学院3，郑州 450000)

叶金，男，1988年出生，助理研究员，粮油质量安全检测

玉米赤霉烯酮是由镰刀菌产生的具有类雌激素作用的一类真菌毒素[1]，广泛存在于玉米、小麦、高粱等粮谷类作物中。误食玉米赤霉烯酮会产生急慢性中毒，如动物雌激素水平提高，动物流产、死胎、畸形等生殖异常，还具有肝毒性、免疫毒性及细胞毒性等[2-4]。玉米赤霉烯酮的污染受到世界各国的重视，GB/T 2761—2017《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》[5]规定了玉米、小麦中玉米赤霉烯酮最高限量为60 μg/kg。

目前，国内外检测玉米赤霉烯酮的方法主要有薄层色谱法[6]、免疫亲和层析荧光光度法[7]、酶联免疫吸附法[8]、免疫胶体金快速测定法[9]、气相色谱-质谱联用法[10,11]、高效液相色谱法[12-14]、液相色谱质谱联用法[15-17]等。薄层色谱法检测步骤烦琐，重现性差，灵敏度低。免疫亲和层析荧光光度法、酶联免疫吸附法、胶体金试纸条法属于快检方法，适用于粮库、企业等收粮过程的简单筛查。高效液相色谱法、液相色谱质谱联用法适用于实验室内精确定量。但现有普遍使用的免疫亲和柱层析高效液相色谱法存在前处理复杂、耗时长，人为因素引入误差和错误的风险高，对人员技术水平要求高，人员暴露在真菌毒素和试剂污染环境中时间长的问题。

本研究将针对免疫亲和柱层析高效液相色谱法检测真菌毒素存在的弊端，结合全自动固相萃取技术，开发自动免疫亲和柱净化-高效液相色谱检测粮油中真菌毒素的方法，系统考察其方法性能，并与国标方法进行对比。本方法简单、快速、通量高适用于大批量粮油中玉米赤霉烯酮的精准测定，将为粮油中玉米赤霉烯酮检测和污染风险评估工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Fotector Plus全自动固相萃取仪；I-Class高效液相色谱仪；AutoEVA-60全自动浓缩氮吹仪；甲醇、乙腈；PBS盐包、吐温-20；超纯水；Evergreen TREA玉米赤霉烯酮免疫亲和柱； 国家有证标准物质甲醇中玉米赤霉烯酮[GBW(E)100301]，玉米全粉玉米赤霉烯酮成分标准物质[GBW(E)100385]，质控样品全麦粉中玉米赤霉烯酮、玉米油中玉米赤霉烯酮、大米粉中玉米赤霉烯酮、玉米全粉空白。

1.2 仪器条件

色谱条件：Waters BEH-C18柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱温：35 ℃；流动相:乙腈∶水∶甲醇(46∶46∶8)等梯度洗脱。流速为0.2 mL/min，进样量为10 μL。激发波长303 nm；发射波长440 nm。

1.3 样品前处理方法

全自动固相萃取前处理法：准确称取(5±0.01)g样品，加入20 mL 90%乙腈水，涡旋提取20 min，7 000 r/min离心5 min，取5 mL上清液加入20 mL 0.1%吐温-20的PBST缓冲液，7 000 r/min离心5 min，取10 mL过滤液于50 mL离心管内，置于80 mL上样架上，运行编好的仪器方法对样品进行自动净化(具体步骤详见表1，序号1-2进行管路清洗，防止之前样品污染；序号3进行样品液过柱，序号4进行亲和柱淋洗，序号5-7进行淋洗液排空、亲和柱吹干；序号8用甲醇对管路进行置换，防止淋洗液残留影响洗脱效果，序号9-11进行亲和柱洗脱，并在收集盘进行收集)。将洗脱液转移到全自动氮吹仪内于55 ℃以下氮气吹干，用1.0 mL流动相溶解残渣，供液相色谱测定。

GB 5009.209—2016前处理方法：称取(40.0±0.1)g粉碎试样于均质杯中，加入4 g氯化钠和100 mL 90%乙腈水，以均质器高速搅拌提取2 min，定量滤纸过滤。移取10.0 mL滤液加入40 mL水稀释混匀，经玻璃纤维滤纸过滤至滤液澄清，滤液备用。将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取10.0 mL(相当于0.8 g样品)中的滤液，注入玻璃注射器中。 将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以1～2滴/s的流速缓慢通过免疫亲和柱，直至有部分空气进入亲和柱中。 用5 mL水淋洗柱子1次，流速为1～2滴/s，直至有部分空气进入亲和柱中，弃去全部流出液。准确加入1.5 mL甲醇洗脱，流速约为1滴/s。 收集洗脱液于玻璃试管中，于55 ℃以下氮气吹干后，用1.0 mL流动相溶解残渣，供液相色谱测定。

表1 全自动固相萃取步骤

2 结果与讨论

2.1 上样流速优化

为了缩短上样时间，同时保证毒素全部吸附到免疫亲和柱上，考察玉米基质加标稀释液在上样流速为1、2、3、4、5 mL/min时的柱回收率，结果如图1所示，流速为1～5 mL/min时，回收率在95.8%～100.7%，RSD在1.7%～6.2%，均符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求。但是4 mL/min时开始回收率有一定的下降趋势，因此选择3 mL/min的流速，即保证时效性又保证回收率最佳。

图1 上样流速对ZEN回收率的影响

2.2 气推次数的优化

气推程序通过快速加压将柱子内残留的液体排出，淋洗之后，柱子内的残留液体是否排干会影响氮吹的时间以及洗脱效果，因此需要对气推次数进行优化，以确保柱子吹干，结果如图2所示，以80 mL/min流速气推3次后柱子质量变化不显著，说明气推3次后柱子已吹干。

图2 气推次数对柱子吹干情况的影响

2.3 方法线性、检出限及定量限

按照逐级稀释法配制玉米赤霉烯酮标准曲线，按照样品前处理方法对空白样品进行处理获得空白基质液，采用空白基质液逐级稀释方法获得玉米赤霉烯酮的检出限(LOD，S/N≥3)和定量限(LOQ，S/N≥10)。结果见图3，玉米赤霉烯酮标准曲线的线性相关系数为0.999 5，检出限为7 μg/kg，定量限为20 μg/kg，均满足日常检测需要。

图3 玉米赤霉烯酮标准曲线的线性方程和相关系数

2.4 日内精密度及回收率

采用本方法和国标方法GB 5009.209—2016分别对配制的高、中、低三个浓度梯度的玉米加标样品进行双试验检测，结果见图4，GB 5009.209—2016和本方法的回收率在99.0%～112.5%，RSD值在

图4 本方法和国标方法在玉米样品中加标回收率对比

1.5%～3.2%范围内，符合GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》要求。采用配对t检验法比较两种方法的检测结果是否存在显著性差异，30 μg/kg的td=0.22，60 μg/kg的td=1.84, 120 μg/kg的td=1.95，均小于查表所得的t0.05,5=2.57，说明测定结果与国标方法无显著性差异。

2.5 日间精密度及回收率考察

分别采用本方法和国标方法每3 h测定中浓度加标样品一次，连续测定18次，结果见图5，国标方法的日间平均回收率为105.6%，日间标准偏差为5.3%，全自动固相萃取仪的日间平均回收率为104.2%，日间标准偏差为4.9%均满足国标规定的回收率和稳定性要求。按照GB/T 4889—2008《数据的统计处理和解释 正态分布均值和方差的估计与检验》中7.1单总体方差或标准差检验实施X2分布检验，判断该方法重复性测定标准偏差是否超过标准方法中规定的重复性要求，同时采用18次极差与现有国家标准规定的18次测定重复性临界极差进行对照，考察该方法的重现性。结果表明，本方法的重复性测定标准差和18次测定极差均未超过国家标准规定的精密度要求，稳定性满足标准要求。

图5 本方法和国标法连续测定18次的加标回收率

2.6 台间差考察

为了考察仪器的稳定性，随机选择两台设备分别对全麦粉玉米赤霉烯酮、玉米油玉米赤霉烯酮、大米粉玉米赤霉烯酮质控样品进行双试验检测，结果见图6。采用配对t检验法比较两台设备的检测结果是否存在显著性差异，两台仪器测定全麦粉玉米赤霉烯酮的td为0.578 7，玉米油玉米赤霉烯酮的td为0.997 2，大米粉玉米赤霉烯酮的td为1.753 4，均小于查表值t0.05,5为2.570 6，因此两台仪器不存在显著性差异。

图6 2台仪器对3种质控物质的测定结果

2.7 方法的准确性考察

使用两台设备对玉米全粉玉米赤霉烯酮成分标准物质[GBW(E)100385]、全麦粉玉米赤霉烯酮、玉米油玉米赤霉烯酮、大米粉玉米赤霉烯酮进行检测。结果见表2，仪器1和仪器2所有结果均落在有证标准物质或参考物质赋值范围内。

表2 2台仪器对4种有证标准物质或参考物质的测定结果

2.8 仪器空白考察

随着全自动固相萃取仪器使用次数的增加，有可能会有玉米赤霉烯酮残留的情况。因此每天进样前和处理完成之后对仪器空白的监测非常必要。图7是连续6 d的仪器空白与标准品的对比色谱图，可以看出仪器无残留现象。

图7 仪器空白与标准品的对比图

3 结论

通过本方法对6个样品从上样到洗脱完成的前处理时间为35 min，检出限为7 μg /kg，定量限为20 μg /kg，相关系数为 0.999 5，加标回收率为99.0%～110.4%，日内相对标准偏差为1.5%～2.1%(n=6)，日间相对标准偏差为6.1%(n=18)，测定4种质控物质的结果均在标准物质标示值范围内，无显著台间差，无仪器残留。本方法能够最大限度地减少实验人员工作量，提高工作效率，避免因人员操作导致的结果偏差，降低实验人员暴露在真菌毒素和有机试剂中的风险，可用于大量粮油样品中玉米赤霉烯酮的精准测定。