甲状腺相关眼病泪液α1-抗胰蛋白酶的表达量及临床意义

吴 钰，鲁 奕，孙 柔，张 硕，孙 静，周慧芳，范先群

上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科，上海市眼眶病眼肿瘤重点实验室，上海 200011

甲状腺相关眼病（thyroid-associated ophthalmopathy，TAO）是弥漫性甲状腺肿（diffuse goiter）伴甲状腺功能亢进症（hyperthyroidism）最常见的甲状腺外表现。25%～50%的甲状腺功能亢进症患者并发TAO，其他一些自身免疫性甲状腺疾病如桥本甲状腺炎，也有可能发生眼病[1]。TAO居成年人眼眶病发病率之首，年发病率为每10万人中女性16.0人、男性2.9人[2]。TAO的病因尚不明确，目前认为可能的发病机制是由于眼眶组织与甲状腺组织中存在共同抗原，如促甲状腺素受体（thyroidstimulating hormone receptor，TSHR）、胰 岛 素 样 生 长因 子-1受 体（insulin growth factor-1 receptor，IGF-1R）等[3]。循环中升高的自身免疫相关抗体引起了交叉免疫反应，病变累及眼眶组织，表现为球后淋巴细胞过度浸润、脂肪组织异常增生、眼外肌肥大与纤维化变性。TAO的临床表现复杂，包括眼球突出、眼睑退缩、眼球运动障碍、斜视、复视等症状，甚至出现暴露性角膜炎和压迫性视神经病变（dysthyroid optic neuropathy，DON）等[4]。TAO的病理特征为眼球后软组织及眼外肌的慢性自身免疫性炎症浸润[5]。TAO患者特别是活动期患者常出现畏光、结膜充血、流泪、异物感、针刺感等眼表不适症状，超过80%的TAO患者有眼干燥症[6]。TAO患者发生眼干燥症的原因包括眼球突出、眼睑退缩导致的暴露因素，还包括泪液分泌功能下降、泪膜稳定性的下降等。大量淋巴细胞在泪腺及眼表浸润，以及炎症因子的释放损害了正常的泪液分泌的神经传导，影响泪液分泌的质与量，进而影响了眼表微环境的稳态。有研究[7]报道TAO患者泪液中多种炎症相关细胞因子的平衡遭到破坏，多种炎症因子的表达水平显著上升，且活动期患者泪液中的含量显著高于静止期。α1抗胰蛋白酶（α1-antitrypsin，α1-AT）是一种急性时相反应蛋白，是人类泪液蛋白中一种重要的组成成分，对蛋白酶具有抑制效果，具有抗炎、抑制细胞凋亡的功能，还具有调节免疫应答、影响补体激活以及炎症反应的作用。泪液中α1-AT在正常情况下表达量较低，有研究[8]表明眼干燥症患者泪液中α1-AT表达量上升。本研究通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测不同临床分期的TAO患者泪液α1-AT表达量并与健康对照组泪液比较，旨在探究TAO患者泪液α1-AT水平特点及其临床意义，探究其在TAO诊断中的价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2019年1—12月于上海交通大学医学院附属第九人民医院眼科就诊的TAO患者。纳入标准：①18岁以上。②TAO诊断明确。③甲状腺功能控制稳定，即总三碘甲状腺原氨酸（total triiodothyronine，tT3）及总四碘甲状腺原氨酸（total tetraiodothyronine，tT4）正常1个月以上。④就诊前3个月内未进行糖皮质激素治疗或球后放射治疗。排除标准：①既往有眼干燥症病史等眼表疾病或眼外伤史。②患有影响眼表功能的疾病如糖尿病或其他自身免疫性疾病。③ 曾行眼表手术、内眼手术、眶减压手术。④有急性或慢性感染性疾病。⑤3个月内佩戴过隐形眼镜。⑥3个月内使用过人工泪液和其他药品。本研究经上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

TAO的诊断参照Bartley标准[9]，即眼睑退缩合并以下任意1项：①眼球突出。②甲状腺功能异常史。③眼外肌受累。如无上睑退缩则必须具备：①甲状腺功能异常史。②合并有眼球突出、眼外肌受累或视功能障碍之一。③排除其他眼部疾病引起的眼睑退缩、眼球突出和眼球运动障碍。

患眼采用临床活动性评分（clinical activity score，CAS）评估疾病活动性（每项计1分，≥3分评估为活动期）。共7项，包括眼睑充血、眼睑水肿、结膜充血、结膜水肿、泪阜红肿、自发性球后疼痛、凝视或眼球活动时疼痛。

1.2 样本采集与检测

1.2.1 泪液样本的采集 眼表面麻醉下，将圆形泪液检测滤纸片置入颞下方球结膜囊内，轻轻闭合眼睑，5 min后取出滤纸，放入已经预存磷酸盐缓冲液0.5 mL（0.01 mol/L，pH 7.4）的1.5 mL离心管中，置于-20 ℃冰箱内保存。

1.2.2 泪液中α1-AT含量的测定 采用ELISA法。采用α1-AT检测试剂盒（Novus Biologicals，美国）。测定步骤：在酶标包被板上设标准孔8孔，按要求对标准孔进行稀释与加样，将稀释后的样品加于酶标板孔底部，标准孔与各样品孔加样量均为50 μL，用封板膜封板后孵育2 h，并将洗涤液稀释至工作浓度后备用。孵育完成后小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加200 μL洗涤液，静置30 s后弃去，甩干，如此重复4～5次。每孔加入50 μL酶标抗体，封板后孵育1 h，重复前述洗涤步骤。洗涤后，每孔加入链霉亲和素过氧化物酶结合物50 μL，孵育0.5 h，洗涤。每孔加入50 μL显色底物，孵育12 min至显色，加入50 μL终止液终止反应，迅速使用Multiskan™ FC酶标仪（ThermoFisher Scientific，美国）测量各孔吸光度D（450 nm）。根据D（450 nm）绘制标准曲线（standard curve）后，计算出样品α1-AT浓度。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 一般资料比较

共纳入TAO 患者30人共55只患眼。按CAS分为TAO 活动期组17人共33 只患眼，年龄范围18～62岁。TAO 静止期组13人共22只患眼，年龄范围30～65岁。同时期就诊的30例健康志愿者为对照组共30只正常眼，年龄范围18～65岁。TAO活动期 组、TAO静止期组与健康对照组的年龄、性别比较差异无统计学意义（表1）。

表1 3组研究对象的一般资料比较Tab 1 General information of three groups

2.2 3组间泪液的α1-AT浓度比较

3组间泪液α1-AT浓度测定结果见表2、图1。3组间差异有统计学意义（H=50.55，P=0.000）。继续进行组间比较，结果显示：与健康对照组相比，活动期TAO患者泪液中的α1-AT浓度显著增高，差异有统计学意义（P=0.000）。与静止期TAO组间比较，活动期TAO组α1-AT浓度显著升高，差异有统计学意义（P=0.000）。静止期TAO组与健康对照组间比较差异无统计学意义（P=0.165）。

表2 3组泪液的α1-AT浓度比较Tab 2 Comparison of α1-AT concentration in three groups

图1 3组泪液α1-AT浓度比较Fig 1 Comparison of tear α1-AT level among three groups

2.3 TAO患者泪液α1-AT浓度与CAS评分的相关性

将TAO患者泪液α1-AT浓度与CAS评分数据绘制散点图，见图2。可见两者存在一致的变化趋势。Spearman相关分析结果显示，TAO患者泪液中α1-AT浓度与CAS评分呈显著正相关（r=0.846，P=0.000）。

图2 TAO患者泪液α1-AT浓度与CAS评分的相关性Fig 2 Correlation between tear α1-AT level and CAS in TAO patients

2.3 ROC曲线

以泪液α1-AT浓度诊断活动期TAO的接受者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC curve），见图3。ROC曲线下面积（area under curve，AUC）为0.959（95%CI0.914～1.000，P=0.000）。由此可见α1-AT浓度在TAO活动性分期诊断中具有较高的价值。当α1-AT浓度临界值为939.48 ng/mL时，约登指数（Youden index，YI）最大，为最佳临界值；此时诊断活动期TAO的敏感度为81.8%，特异度为100%。

图3 泪液α1-AT浓度用于TAO活动性诊断的ROC曲线Fig 3 ROC curve of tear α1-AT in TAO patients

3 讨论

TAO是一种慢性自身免疫性眼眶病，发病率居成年人眼眶病之首，病理表现为眼眶成纤维细胞的增生、脂肪细胞增殖、细胞外基质的沉积等眼眶组织淋巴细胞浸润性病变[10]。泪腺是眼免疫系统的重要组成成分。Eckstein[11]等发现泪腺腺泡细胞与球后成纤维细胞表面同样表达促甲状腺素受体（ thyroitropin receptor，TSHR），证实泪腺是TAO的靶器官之一。影像学表现方面，TAO患者的泪腺改变表现为体积增大、信号值增高、呈炎症表现。病理学研究证实TAO患者泪腺组织发生淋巴细胞浸润及脂肪增殖。临床上，TAO患者常有显著的结膜充血水肿、畏光流泪、眼干异物感等眼表症状，伴有泪膜破裂时间缩短，眼表疾病指数升高，眼干燥症状明显，严重者出现角膜上皮脱落、角膜溃疡甚至穿孔，严重危害视功能[12]。正常的眼表覆盖一层泪膜，而稳定的泪膜是维持眼表健康的基础。TAO患者的眼表症状一方面与眼球突出度增加、睑裂增宽、泪液蒸发加速有关；另一方面与泪腺受累，发生自身免疫炎症改变，导致泪液分泌功能下降、泪液成分改变密切相关。泪腺分泌的泪液具有维持眼表微环境稳态、抵御眼表微生物病原等重要作用。泪液中含有多种炎症反应蛋白，文献报道TAO患者泪液中的多种炎症因子如白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-7、IL-17A、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、前列腺素（prostaglandins，PGs）、神经生长因子（nerve growth factor，NGF）等较健康者显著增高，且部分指标水平与疾病活动度、影像学泪腺体积呈正相关[7,13-15]。泪液成分的平衡遭到破坏，可能促进泪腺炎症以及免疫反应过程中淋巴细胞的迁移，损害正常的泪液分泌神经传导，进而参与TAO自身免疫反应的发病过程。泪腺组织获取难度较大，而泪液的采集是无创伤、易得到的，因此通过泪液成分的检测来间接反映泪腺及眼表组织的功能状态，寻求疾病诊断和活动分期的可能指标，具有重要的临床意义。

α1-AT为多种蛋白水解酶的抑制剂，是生理循环中一种重要的防御蛋白。α1-AT具有抗炎、抑制细胞凋亡、维持机体内环境稳定的功能，还具有调节免疫应答，影响抗原-抗体免疫复合物清除、补体激活以及炎症反应的作用[16-17]。有研究[18]将α1-AT用于治疗自身免疫性皮肤病银屑病，在动物模型上取得了显著的疗效，提示了α1-AT在自身免疫性炎症反应中的调节作用。通常情况下α1-AT在泪液中表达量较低，在部分眼部疾病情况下会出现泪液α-1抗胰蛋白酶的改变[19]。1项针对长期角膜接触镜佩戴者的试验[8]发现，在眼表受到长期刺激后泪液α1-AT浓度显著增高。另1项关于角膜溃疡的研究[20]发现，角膜溃疡患者泪液中α1-AT浓度显著升高，达基线的20倍。1项TAO患者泪液蛋白质谱研究[21]中首次报道了α1-AT的含量上调，而对于该蛋白在TAO患者泪液中的表达量及在临床分期中意义的深入研究尚属空白。因此，本研究收集了活动期、静止期以及健康对照组的泪液样本进行定量测定，探究其在TAO疾病诊断与临床分期中的意义。

本研究显示，TAO患者的泪液α1-AT浓度较健康对照组显著上调，且活动期患者泪液α1-AT浓度显著高于静止期患者，这与前期的蛋白质谱报道[21]一致。相关性分析得出TAO患者泪液α1-AT浓度与CAS评分呈显著正相关（r=0.846，P=0.000），证明了泪液α1-AT浓度能够反映疾病的活动性。本研究显示TAO患者眼眶炎症可能是通过影响泪腺分泌的泪液成分的表达，间接影响了眼表微环境的稳态，造成眼表病变。本研究纳入的患者虽未发生明显的角膜上皮脱落、溃疡等损害，但其α1-AT浓度的显著上调可能对亚临床眼表损害起到提示作用。静止期TAO患者α1-AT浓度与健康对照组之间比较无统计学意义（P=0.165），这与静止期患者通常病程较长、眼表充血水肿等炎症表现较轻、眼干燥症状较活动期改善相符合。AUC发现以α1-AT浓度作为预测值诊断活动期TAO，具有较高的敏感度和特异度，说明该指标在TAO活动性分期的临床诊断上可能具有较高的价值。目前，TAO活动性分期的诊断依赖于临床表现即CAS评分，而CAS评分的具体指标判定有一定的主观性，往往依赖于医生的临床经验。同时，较为客观的影像学检查如电子计算机断层扫描（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）等耗时较长且费用昂贵。目前TAO尚缺乏一个简单、准确的实验室指标为诊断和预测提供依据。结合本研究的结果，泪液α1-AT浓度的检测无创且准确性高，我们推论未来可能成为临床上有推广价值的诊断性实验室检查指标之一，为TAO的临床诊断提供参考。